Transferência embrionária e técnicas de criopreservação em pequenos ruminantes.r.

Abstract

O presente trabalho engloba vários estudos em transferência embrionária e criopreservação de embriões da espécie ovina. Todos os trabalhos foram realizados na raça ovina portuguesa Merina Preta. O primeiro estudo teve como objectivo a avaliação do efeito da estação do ano - Primavera versus Outono - e da preparação de origem da FSH - FSH ovina (Ovagen®) versus FSH porcina (Pluset®) - na resposta superovulatória e nas taxas de ovulação, de recolha embrionária, fertilização e congelabilidade, bem como no número de embriões viáveis obtidos e número de embriões susceptíveis de serem criopreservados. Concluiu-se ser possível realizar de forma eficaz a estimulação superovulatória nas duas estações do ano, sendo vantajosa a utilização de FSH ovina (Ovagen®) relativamente à FSH porcina (Pluset ®). O segundo estudo teve como objectivo a avaliação da eficácia de três técnicas de criopreservação de embriões: congelação lenta, vitrificação clássica e vitrificação ultra-rápida por OPS, tendo as três técnicas sido avaliadas pelos resultados das transferências dos embriões para fêmeas receptoras da mesma raça. Não se obtiveram diferenças significativas entre as técnicas de criopreservação aplicadas, pelo que os resultados deste segundo estudo indicam que qualquer uma das técnicas utilizadas para criopreservação poderá ser aplicada com sucesso nesta raça. No estudo 3 procedeu-se à avaliação da estrutura celular de embriões de ovino produzidos in vivo, em estadio de mórula compacta, jovem blastocisto e blastocisto. O aspecto mais marcante observado no citoplasma das células embrionárias foi a presença de numerosas vesículas de conteúdo claro. Estas vesículas originam-se a partir de cisternas do complexo de Golgi e retículo endoplasmático, as quais se curvam e fundem entre si originando vesículas de conteúdo claro, que vão incluir diferentes estruturas citoplasmáticas, cisternas e outras vesículas. A estrutura lábil da sua membrana permite a sua coalescência em vesículas de maior dimensão as quais vão absorver mitocôndrias e gotículas lipídicas, dando origem à formação de vacúolos gigantes, na sua maioria preenchidos por um conteúdo lipídico de aspecto denso. No estadio de mórula foi possível observar a exocitose de vesículas imaturas e de aspecto claro para o espaço perivitelino, enquanto no estadio de blastocisto a exocitose, de vesículas maturas e de grandes dimensões, ocorreu para a cavidade blastocélica. As observações deste estudo sugerem que estas vesículas se comportam como organelos autofágicos, apresentando um processo evidente de maturação do estadio de mórula para blastocisto. O objectivo do estudo 4 foi o de avaliar as alterações ultraestruturais induzidas pelo processo de vitrificação por OPS em embriões de ovino produzidos in vivo, no estadio de mórula e blastocisto, em comparação com um grupo controlo (embriões frescos) e com embriões criopreservados por congelação lenta. Procedeu-se à classificação morfológica dos embriões dos cortes semi-finos tendo este tipo de avaliação permitido a identificação adicional de lesões não visíveis por observação à lupa, fornecendo assim informação adicional útil para a compreensão dos resultados obtidos com os diferentes métodos de criopreservação. Não se verificaram diferenças significativas na classificação dos cortes semi-finos de embriões criopreservados por ambos os métodos, o que está de acordo com os resultados de fertilidade e sobrevivência embrionária semelhantes, obtidos no estudo 2. No entanto, nesta classificação, obteve-se um número significativamente maior de blastocistos de grau 3 após criopreservação por OPS. Independentemente do estadio de desenvolvimento considerado e do método de criopreservação utilizado, observou-se que embriões cujo corte semi-fino foi classificado como de grau 1 ou 2 apresentam blastómeros bem preservados com uma estrutura celular intacta, enquanto embriões cuja classificação foi de 3 apresentam células degeneradas, descontinuidade das membranas celulares, severa lesão mitocondrial e desorganização do citoesqueleto. A gravidade e extensão das lesões celulares observada a nível ultraestrutural foi proporcional à observada nos cortes semi-finos dos embriões criopreservados. Assim, a classificação de cortes semi-finos poderá ser utilizada na predição da existência de lesões ultraestruturais em embriões criopreservados. Podemos assim concluir que apesar de todos os métodos de criopreservação estudados poderem ser aplicados com sucesso na criopreservação de embriões in vivo de ovino, a sua aplicação é susceptível de produzir lesão celular nas células embrionárias, pelo que a introdução de melhorias nos vários processos permanece ainda como um objectivo desejável.