Estudo das condições de regeneração de Humulus lupulus L. Var. Nugget e estabelecimento de protocolos para a transferência de genes de resistência a virús (Arabis Mosaic Virus - AMV)

Abstract

O lúpulo (Humulus lupulus) é uma planta com propriedades medicinais, mas a sua produção destina-se sobretudo à indústria cervejeira. O lúpulo é uma matéria-prima de importância crucial no fabrico da cerveja. As diferentes variedades existentes, com as suas resinas e óleos essências, conferem aos diferentes tipos de cervejas existentes no mercado um sabor amargo especial e aroma característico. Os produtores de lúpulo debatem-se hoje com graves problemas de perdas económicas devido à grande sensibilidade desta planta a doenças virais. Neste contexto o melhoramento, com o objectivo de introduzir resistência, a alguns dos vírus mais nefastos a esta cultivar, assume um papel importante. Entre os vírus que maiores perdas têm causado encontra-se o AMV. O objectivo deste estudo é contribuir para a definição de protocolos de regeneração e transformação de molde a obter plantas trangénicas da variedade Nugget, resistentes ao AMV. Numa primeira fase deste trabalho foi efectuado o estabelecimento in vitro de Humulus lupulus L. var. Nugget. Após desinfecção, os explantes foram inoculados em meio Adams suplementado com 0,75 mg/1 de IBA, 0,2 mg/1 de BAP e 20g/1 de glucose. Numa Segunda fase estudaram-se as condições de regeneração de pecíolos e entrenós. A regeneração a partir de entrenós apresentou resultados ligeiramente superiores. Dos meios testados, o meio MS' suplementado com 0,01 mg/1 de IAA, 0,05 IBA, 2 mg/1 de BAP e 1,5 mg/1 de Zea e o meio MS' suplementado com 0,02 mg/1 de IAA e 2 mg/1 de IBA foram aqueles que conduziram a melhores resultados. A regeneração desta variedade foi também possível em meio líquido, utilizando em meio MS' suplementado com 0,015 mg/1 de IAA, 0,01 mg/1 de IBA e 3,5 mg/1 de Zea. No entanto, o tempo necessário para obter as primeiras plântulas é cerca de 3 vezes superior, quando comparado com os resultados em meios sólidos. Contudo, o número de rebentos obtidos por explante é bastante superior. As etapas de regeneração foram seguidas por um estudo histológico, o qual revelou a existência de uma via morfogénica idêntica à referida por Castro (1998) para a variedade Eroica da mesma espécie. Inicialmente foram observados centros de organização provavelmente derivados de células xilémicas neoformadas com origem cambial, os quais acabaram por estar na origem de rebentos que originam as plântulas regeneradas. Este sistema de regeneração foi utilizado em estudos preliminares de transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os estudos foram realizados em calli, obtidos a partir de entrenós, utilizando-se o plasmídio p35S GUS INT como vector de transformação. A expressão transiente dos genes de referência da - glucuronidase (GUS) foi observada nos calli, utilizando a reacção histoquímica com XGluc. *** Abstract - The hop (Humulus lupulus) is a plant with medicinal properties, but its large scale production is intended mainly for the brewery industry. Hop is the crucial raw material in the brewing of beer. The existing different varieties, with their resins and essential oils are responsible for the particular bitter taste and characteristic aroma from the various beer varieties that exist in the market. Hop producers are struggling at the moment with problems of serious economic losses due to this planes great sensitivity to viral diseases among others. In this context, improvement, aiming at introducing resistance to some of the viruses most destructive of this cultivar takes on an important role. AMV disease is among the viruses that cause the greatest losses. This study aims to contribute to the definition of regeneration and transformation protocols, so that it will be possible to obtain transgenic plants, of Nugget variety, that are resistant to AMV. The first step of this study was to establish the in vitro set up of the Humulus lupulus L. Nugget variety. After sterilization, explants were inoculated on an Adams medium, with 0.75 mg/l IBA, 0.2 mg/1 BAP and 20 g/l glucose. In the second step, petioles and internode regeneration conditions were studied. Regeneration from the internodes, show a slightly higther regeneration rate. Among the medium tested, the MS' medium with 0.01 mg/l. IAA, 0.05mg/1 IBA, 2 mg/1 BAP and 1,5 mg/1 Zea and the MS medium with 0.02 mg/l IAA. and 2 mg/1 IBA were those that showed a higher regeneration rates. Regeneration of this variety was also achieved in liquid medium, like it was observed on the MS' medium with 0.015 mg/l IAA, 0.01 mg/1 MA and 3.5 mg/1 Zea. However, the time required to obtain the first plantlets was three times higher, when compared to that required when culture was performed on solid medium. However, the number of pinatlets obtained per explant is much higher. The histological study of the morfhogenic steps has revealed identical to that one reported by Castro (1998) for the Eroica variety of the same specie. Initially, it was observed that organization centres, probably derived fom xylemic newly formed ce11s from cambial origins, formed stem meristems wich gave rise to the regenerated plantlets. The first mediated transformation protocols for gene transfer were assayed using Agrobacterium tumefaciens. Studies were carried out on calli, obtained from internodes, using p35S GUS INT plasmid as vector. The transient expression in calli was detected by the histological stain for β - glucuronidase (GUS).