EXPRESSÃO DE CASPASES EM CÉLULAS DE MELANOMA OCULAR ANALISADA POR WESTERN BLOT APÓS TERAPIA FOTODINÂMICA COM NOVA CLORINA

Abstract

Introdução: A terapia fotodinâmica (PDT) é uma modalidade terapêutica minimamente invasiva baseada na ativação de fotossensibilizadores por luz visível em comprimentos de ondas específicos, resultando na produção de espécies reativas de oxigênio capazes de induzir morte celular em tratamentos oncológicos1. O estudo de novos fotossensibilizadores é fundamental para ampliar a aplicabilidade clínica da PDT em animais e humanos. Recentemente, desenvolvemos um grupo de novas clorinas que tem demonstrado elevada citotóxicidade em diferentes células cancerígenas, com destaque o melanoma2,3,4. Os mecanismos moleculares subjacentes à morte celular induzida por este novo fotossensibilizador, envolvimento das vias da apoptose, são investigadas. Objetivos: Avaliar a ativação das vias apoptóticas intrínseca e extrínseca após tratamento fotodinâmico com a nova clorina (derivado dihidroximetilo de 4,5,6,7-tetra-hidropirazolo[1,5-a]piridina fundido com tetrafenilclorina), por Western blot de caspases efetoras e iniciadoras (Caspase-3, Caspase-8 e Caspase-9), em células do melanoma ocular. Materiais e métodos: Células de melanoma ocular (MP-41) foram cultivadas e submetidas PDT com nova clorina a 0, 100 e 500 nM. Após 24 h da irradiação, as células foram lisadas em tampão RIPA. As proteínas totais foram quantificadas por método BCA, desnaturadas e submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida de transferência para membranas de PVDF. As membranas foram incubadas com anticorpos primários para Caspase-3, Caspase-8 e Caspase-9, seguidos dos anticorpos secundários. A leitura foi realizada por fluorescência e expressão das caspases foram avaliadas por análise das bandas correspondentes. Resultados: O tratamento fotodinâmico com a nova Clorina modulou a expressão de proteínas envolvidas nas vias apoptóticas em células de melanoma ocular. Observou-se clivagem significativa da Caspase-3 após PDT, com diminuição da procaspase (32 kDa) e aumento da forma clivada (17 kDa), sendo o efeito mais pronunciado a 500 nM (p<0,001). A expressão de Caspase-8 apresentou redução dependente da concentração, com maiores reduções a 500 nM (p=0,0113). Para a Caspase-9, verificou-se diminuição da forma de maior peso molecular (46 kDa) e aumento da forma clivada (35 kDa), confirmando ativação das vias apoptóticas, especialmente com a 500 nM (p=0,0104).Conclusão: Este estudo evidencia que a nova clorina desencadeia apoptose em células de melanoma ocular por ativação simultânea das vias intrínseca e extrínseca, reforçando o seu potencial como fotossensibilizador promissor em terapias antitumorais. Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal e Fundo Social Europeu (FSE), através de uma bolsa de doutoramento atribuída a T.G.G. (SFRH/BD/139319/2018 e COVID/BD/152962/2023), para R.T. (SFRH/BD/116794/2016) e para B.S. (2020.07672.BD). O CIBB é financiado por Fundos Nacionais via FCT (Fundação para a Ciência e Tecnologia) através dos Projetos Estratégicos UID/NEU/04539/2019, UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, e pelo COMPETE-FEDER (POCI-01-0145 -FEDER-007440). Bibliografia: 1Guimarães, T.G., Cardoso, K.M., Tralhão, P., Marto, C. M., Alexandre, N., Botelho, M. F., & Laranjo, M. (2021). Current Therapeutics and Future Perspectives to Ocular Melanocytic Neoplasms in Dogs and Cats. Bioengineering, 8(12), 225. 2Laranjo, M., Aguiar, M. C., Pereira, N. A., Brites, G., Nascimento, B. F., Brito, A. F., ... & e Melo, T. M. P. (2020). Platinum (II) ring-fused chlorins as efficient theranostic agents: Dyes for tumor imaging and photodynamic therapy of cancer. European Journal of Medicinal Chemistry, 200, 112468 3Laranjo, M., Pereira, N. A., Oliveira, A. S., Aguiar, M. C., Brites, G., Nascimento, B. F., ... & e Melo, T. M. P. (2022). Ring- Fused meso-Tetraarylchlorins as Auspicious PDT Sensitizers: Synthesis, Structural Characterization, Photophysics, and Biological Evaluation. Frontiers in chemistry, 10. 4Pereira, N. A., Laranjo, M., Pineiro, M., Serra, A. C., Santos, K., Teixo, R., ... & e Melo, T. M. P. (2015). Novel 4, 5, 6, 7- tetrahydropyrazolo [1, 5-a] pyridine fused chlorins as very active photodynamic agents for melanoma cells. European Journal of Medicinal Chemistry, 103, 374,380.