Uso de marcadores moleculares aplicados à rastreabilidade dos Azeites.

Abstract

A oliveira (Olea europaea L.) é uma das mais antigas culturas arbóreas da bacia do Mediterrânico (Raieta et al. 2015), com uma importância económica, social e cultural inegável na região. A qualidade e características do azeite depende significativamente da escolha da variedade que lhe dá origem. Algumas cultivares de azeite são reconhecidas como de alta qualidade, e derivam de áreas geográficas bem definidas; como consequência dão origem a produtos que impõem preços mais elevados no mercado (Vietina et al. 2011; Raieta et al. 2015). Dado o seu impacto económico, estes produtos podem tornar-se alvo de fraudes e adulterações (Aparicio et al. 2013). Neste contexto, várias Instituições Internacionais têm ativamente elaborado regulamentação de antifraude, exigindo um controlo mais rigoroso nos países produtores e importadores, impondo normas uniformes de rotulagem e técnicas instrumentais precisas na rastreabilidade do azeite (Aparicio et al. 2013). A União Europeia emitiu regras específicas sobre a produção de azeite e seu mercado: Regulamento CE nº 865/2004, a marca de Denominação de Origem Protegida (DOP) e a marca de Indicação Geográfica Protegida (IGP). Em Portugal estão registadas seis regiões DOP relativas a azeites virgens, produzidos a partir de onze variedades Portuguesas e incluindo produtos mistos e monovarietais. Urge o desenvolvimento de métodos que permitam identificar com precisão as variedades de oliveira para proteger a tipicidades destes produtos. As metodologias analíticas que têm sido usadas para análise da composição do azeite [Cromatografia Gasosa (GC), Cromatografia em Coluna de Sílica Gel, Cromatografia Líquida de Alta performance (HPLC) e técnicas espectroscópicas, como ressonância magnética nuclear (RMN) e a espectroscopia no infravermelho (Martins-lopes et al. 2008; Montealegre et al.2010) apresentam algumas limitações devido à alta variabilidade dos compostos presentes no azeite. Adicionalmente, estes métodos são sensíveis às condições ambientais e ao processamento associado à técnica, dificultando a interpretação dos resultados obtidos (Martins-lopes et al. 2008; Raieta et al. 2015). Como alternativa, o uso de marcadores moleculares tem despertado interesse pela sua menor sensibilidade às condições ambientais (Martins-Lopes et al. 2008; Montealegre et al. 2010), tendo o potencial de se tornarem uma ferramenta sólida de diagnóstico para autenticidade dos alimentos e de rastreabilidade. No âmbito do Projeto Por3O a decorrer na Universidade de Évora, pretende-se desenvolver uma ferramenta molecular para identificação das variedades usadas na produção de um determinado azeite. Idealmente, essa ferramenta a demonstrar-se robusta, poderá ser proposta para a deteção de fraudes e no apoio à certificação do azeite. A estratégia seguida teve por base o uso de marcadores Single Sequence Repeats (SSRs) para avaliar a variação genética em cinco variedades Portuguesas representativas dos olivias tradicionais da região do Alentejo ('Galega vulgar', 'Carrasquenha' 'Cordovil de Serpa', 'Cobrançosa' e 'Verdeal Alentejana'). Adicionalmente, foram avaliadas duas variedades não Portuguesas ('Arbequina' e 'Picual'), as quais podem representar risco de contaminação considerando a área de olival que atualmente ocupam nesta região. Tendo em conta a informação existente relativa à utilização de SSRs na genotipagem de variedades de oliveira, recorreu-se à técnica de High-Resolution Melting technique (HRM). Esta técnica, mais económica, rápida e de fácil execução, foi utilizada numa primeira fase para selecionar os SSRs mais polimórficos (com uma maior capacidade discriminatória) de entre um conjunto de 31 SSRs descritos na literatura. Selecionou-se um conjunto de 6 SSRs para identificar as variedades consideradas no estudo, e após uma primeira análise dos mesmos, selecionou-se apenas 3 SSRs (que foram caracterizados por sequenciação Sanger precedida de clonagem) para a análise de fragmentos por electroforese capilar. Como parte da verificação da autenticidade do azeite, foi demonstrada a aplicabilidade dos 3 SSRs selecionados em azeites. A extracção de DNA permanece um passo crítico dada a necessidade de uma quantidade mínima de DNA com integridade suficiente e sem inibidores da actividade enzimática, de modo a permitir a amplificação dos diferentes SSR. A degradação do DNA por nucleases, bem como a presença de compostos fenólicos, podem inibir a atividade da DNA polimerase e consequente não amplificação das regiões pretendidas (Raieta et al. 2015). Contudo, um protocolo de extracção de DNA do azeite, baseado no clássico protocolo CTAB, revelou-se robusto e eficiente na amplificação dos 3 SSRs previamente selecionados.