Improvement of chickpea rhizobia by genetic transformation with symbiosis genes

Abstract

Rhizobia are soil bacteria able to induce the formation of nodules in leguminous plants and convert atmospheric nitrogen into assimilable forms to these plants. Some Mesorhizobium species establish symbiosis with chickpea and can increase productivity of this culture. Rhizobia symbiosis genes, such as nod and nif, are involved in nodule development and nitrogen fixation. Nevertheless, genes involved in other molecular mechanisms, namely stress response may influence the symbiotic interaction plantrhizobia. The objective of this study was to evaluate the effects of overexpressing symbiotic and stress response genes in the symbiotic performance of chickpea Mesorhizobium. Mesorhizobium strains were transformed with pRKnifA, pRKnodD, pRKenvZ and pRKgroEL (expression vector pRK415 with nifA, nodD, envZ and groEL genes from M. mediterraneum UPM-Ca36T, respectively). From the four strains transformed with extra nifA copies, only V15-b was able to increase plant biomass, when compared to wild-type and empty vector strains. Among the four strains transformed with extra nodD copies, ST-2 and PMI-6 showed a higher symbiotic effectiveness compared to wild type and control strains. Additional copies of envZ led to in a higher symbiotic effectiveness when introduced in PMI-6 and EE-7. Evaluation of the symbiotic effectiveness of the four strains overexpressing groEL showed that only ST-2 improved, compared to wild-type and empty vector strains. For all these strains the rate of nodule formation was seen to be higher and further analysis of the infection process and nodule histological analysis were performed. Overall, this study shows that extra copies of a given gene may have different effects in the symbiotic effectiveness, depending on the modified strain. This study contributes to a better understanding of the nodulation and nitrogen fixation processes, namely regarding the contribution of non-symbiotic genes, especially envZ, which was to our knowledge for the first time reported to be involved in the rhizobia-legume symbiosis; Resumo: Melhoramento de rizóbios de grão-de-bico por transformação genética com genes simbióticos Rhizóbios são bactérias capazes de induzir a formação de nódulos em leguminosas e converter azoto atmosférico em formas assimiláveis por essas plantas. Algumas espécies de Mesorhizobium estabelecem simbioses com grão-de-bico e conseguem promover a produtividade desta cultura. Genes simbióticos, como nod e nif, estão envolvidos na formação dos nódulos e fixação de azoto. No entanto, genes envolvidos noutros mecanismos, nomeadamente a resposta ao stresse podem influenciar a interação simbiótica planta-rizóbio. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência simbiótica de Mesorhizobium de grão-de-bico sobre-expressando genes simbióticos e de resposta ao stresse. Estirpes de Mesorhizobium foram transformadas com pRKnifA, pRKnodD, pRKenvZ e pRKgroEL (vetor de expressão pRK415 com nifA, nodD, envZ e groEL de M. mediterraneum UPM-Ca36T, respetivamente). Das quatro estirpes transformadas com cópias extras de nifA, apenas V15-b foi capaz de produzir um aumento na biomassa das plantas inoculadas, quando comparada às estirpes selvagem e com vetor vazio. Das quatro estirpes transformadas com cópias extras de nodD, ST- 2 e PMI-6 apresentaram maior eficiência simbiótica em comparação com as estirpes controlo. Cópias adicionais de envZ resultaram numa maior eficiência simbiótica quando introduzidas em PMI-6 e EE-7. A avaliação da eficiência simbiótica das quatro estirpes que sobre-expressam groEL mostrou que apenas a transformação de ST-2 levou a uma eficiência superior, em comparação com as estirpes selvagem e com vetor vazio. Para todas estas estirpes, a taxa de formação de nódulos também foi melhorada, pelo que análises do processo de infeção e da histologia dos nódulos foram efetuadas. Em geral, este estudo mostra que um gene introduzido pode ter efeitos diferentes na eficiência simbiótica, dependendo da estirpe modificada. Este estudo contribui para uma melhor compreensão dos processos de nodulação e fixação de azoto, nomeadamente a contribuição de genes não-simbióticos, especialmente envZ, que tanto quanto sabemos não foi previamente descrito como envolvido nestas simbioses.