Post pollination events in a sexually deceptive orchid (Ophrys fusca Link): a transcriptional and a metabolic approach

Abstract

A presente dissertação pretende contribuir para o aumento do conhecimento numa área específica da polinização em orquídeas, designada como polinização deceptiva (sexual deception) usando a espécie Ophrys fusca como modelo. Tendo por base 100 labelos de 100 plantas diferentes, colhidas no seu habitat natural, recorreu-se a técnicas de transcritómica e metabolómica com o objectivo de (1) analisar a expressão génica por microarrays de cDNA após a polinização; (2) proceder à caracterização metabólica por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS). Os resultados obtidos permitiram contribuir para a compreensão dos mecanismos de polinização por sexual deception, nomeadamente no que respeita às características do labelo (ex. pigmentação, emissão de compostos), dos processos de senescência ou da biologia floral das orquídeas. A construção de um chip de cDNA para O. fusca permitirá realizar hibridações com outras espécies de Ophrys, possibilitando a determinação do grau de conservação dos mecanismos genéticos na polinização por sexual deception; ABSTRACT:This work aims at contributing to the knowledge on orchid pollination biology, through the study of the peculiar pollination mechanism of Ophrys fusca by sexual deception. In this mechanism, Ophrys labellum mimics the female sex pheromones thereby deceiving male pollinators that attempt to copulate with the orchid labellum. Labellum transcriptome analysis by a custom-made cDNA microarrays allowed to verify gene expression modulation of post pollination changes. Processes involved in labellum morphology, petal senescence and pollination biology were adressed. A metabolic profiling by gas-chromatography mass- spectrometry was focused on compounds involved in Ophrys-pollinator crosstalk, in order to determine their dynamics after pollination. By means of both transcriptional and metabolic analysis, the work here presented gives an important contribution towards the understanding of orchid pollination biology by deceit. The custom-made cDNA chip may be useful for performing cross-species hybridization to track differences on transcripts modulation thereby disclosing the genetic basis underlying sexual deception; RESUMO:A família das orquídeas (Orchidaceae) inclui mais de 22 000 espécies, representando cerca de 10% das plantas com flor. A sua extraordinária diversidade floral reflecte a importância das relações planta-polinizador na evolução das orquídeas, sendo as diferentes estratégias de polinização consideradas como uma das razões para a diversificação e especiação na família. Os mecanismos de polinização em orquídeas sempre intrigaram os cientistas, incluindo Darwin. Uma das estratégias mais fascinantes na biologia destas plantas é a capacidade de polinização deceptiva, ocorrendo em cerca de 1/3 das espécies. A presença de uma pétala modificada, o labelo, tendo como função principal atrair insectos polinizadores, é igualmente uma das características mais distintivas das orquídeas. Os mecanismos de polinização deceptiva mais comuns incluem a imitação de flores que apresentam néctar (food deception), ocorrendo em 38 géneros; e a imitação de insectos-fêmea (sexual deception), abrangendo 18 géneros. O género Ophrys sempre foi considerado um modelo para estudo de polinização deceptiva, nomeadamente do caso de flores sexualmente deceptivas (sexual deception). As flores deste género emitem substâncias químicas idênticas às feromonas libertadas pelas fêmeas sexualmente receptivas dos insectos polinizadores, bem como apresentam características morfológicas (ex: forma, cor, pilosidade) que mimetizam o corpo dos insectos-fêmea. Os estudos desenvolvidos em polinização de orquídeas têm sido desenvolvidos nas áreas da biologia celular, micromorfologia, genética populacional, análise química e na determinação funcional de determinados genes, bem como em estudos bioquímicos e fisiológicos. Contudo, para a compreensão global de um processo são necessárias técnicas que permitam obter dados a larga escala. Este trabalho pretende constituir um contributo para o conhecimento dos mecanismos regulados pela polinização em orquídeas. Para tal, uma espécie de orquídea selvagem abundante em Portugal, Ophrys fusca Link, foi usada como modelo de estudo do mecanismo de polinização deceptiva (sexual deception). Para atingir o presente objectivo, foram aplicadas duas técnicas diferentes: a análise da expressão génica por microarrays de cDNA e a caracterização metabólica por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS). O labelo foi seleccionado como foco do estudo, dada a sua importância na emissão de compostos importantes na comunicação com o insecto polinizador e no processo geral de polinização em orquídeas. A amostragem foi efectuada em 100 labelos de 100 plantas diferentes no seu habitat natural, e seleccionaram-se dois tempos de estudo: 2 dias após a polinização (DAP) e 4 DAP.A análise do labelo por microrrays de cDNA permitiu verificar a modulação da expressão génica após a polinização. Com este estudo de larga escala conseguiu-se verificar que aos 2 DAP, o evento de polinização é reconhecido como uma resposta a um stress e aos 4 DAP, detectaram-se genes que indicam a mobilização de nutrientes bem como uma nova síntese proteica, necessária para a progressão específica da senescência do labelo. A polinização despoleta processos de proteólise, mobilização de nutrientes como o fosfato, carbono e azoto, e desactiva mecanismos energeticamente dispendiosos, como a fotossíntese e fotorespiração bem como as principais vias metabólicas que permitem manter a vitalidade do labelo. Os transcritos identificados revelam processos importantes do metabolismo secundário envolvidos em características do labelo (ex. pigmentação, emissão de compostos), em proteólise a larga escala (ex. proteases cisteínicas) e dirigida (ex. fosfatases e quinases), stress e defesa, além de vias associadas à mobilização de nutrientes. Inicialmente, a expressão génica de diversos transcritos descritos em situações de stress e de patogenicidade (ex. GST, proteínas Lea5, metalotioneínas tipos 2 e 3, quitinases, proteínas PR, proteases cisteínicas, RNases) indicam que a modulação da transcrição é regulada por vias não específicas de reconhecimento do evento de polinização, semelhantes a uma situação de stresse abiótico e/ou biótico. Contudo, aos 4 DAP, verificou-se a transcrição de genes associados à síntese proteica, indicando a activação de um novo processo de tradução de proteínas específicas que irão dirigir o labelo para a morte celular irreversível. A análise do perfil metabólico dos extractos dos labelos foi focada em compostos da cutícula, especificamente alcanos e alcenos, descritos como responsáveis por despoletar o comportamento de pseudocópula dos machos polinizadores. Os resultados demonstram que, após a polinização, a quantidade total dos compostos não diminui, estando de acordo com resultados anteriores observados em Ophrys sphegodes. Esta observação poderá dever-se à função que estes compostos desempenham, nomeadamente como parte integrante das camadas das ceras prevenindo a desidratação. A análise do labelo após a polinização por microarrays permitiu a identificação de transcritos, nomeadamente duas sequências de stearoil ACP desaturase (SAD), envolvidos nas vias biossintéticas dos compostos da cutícula, importantes na interacção Ophrys-polinizador. A subexpressão destes transcritos em conjugação com a manutenção da produção do odor após a polinização indica que a correlação entre os níveis de expressão dos genes com os seus produtos de síntese não pode ser directamente efectuada. O estudo do labelo após a polinização por técnicas de proteómica irá permitirá a detecção das enzimas bem como alterações pós tradução importantes na regulação das proteínas. Esta abordagem irá possibilitar a compreensão da regulação das proteínas após o evento de polinização. O presente estudo permitiu obter uma visão geral no labelo dos mecanismos regulados pela polinização, contribuindo para a compreensão da polinização por sexual deception recorrendo a técnicas de Ó’micas. A análise do labelo através de técnicas de transcritómica e metabolómica após a polinização permitiu dar um importante contributo para a compreensão dos processos de senescência, características do labelo (ex. pigmentação, emissão de compostos), bem como da biologia floral das orquídeas. Além disso, a construção de um chip de cDNA construído especificamente para a orquídea em estudo irá permitir a realização de hibridações com outras espécies do mesmo género, possibilitando o estudo da conservação dos mecanismos genéticos na regulação dos eventos pós-polinização de orquídeas com flores sexualmente deceptivas; ABSTRACT:Orchidaceae family includes more than 22,000 species of plants, representing around 10 % of all flowering plants. The extraordinary floral diversity in orchids reflects the importance of plant-pollinator associations in their evolution, and pollination biology is regarded as a driving force in orchid diversification and speciation. Pollination biology in Orchidaceae has long intrigued evolutionary biologists, and interest in orchid pollination dates back to Darwin. The most fascinating in orchid biology is pollination by deception, occurring in approximately 1/3 of the species, being food (38 genera) and sexual (18 genera) deception the most common types. Sexual deception mechanism was first described in the European Ophrys genus by Pouyanne in 1917, and in this mechanism, Ophrys orchids mimic their pollinators’ mating signals, and are pollinated by male insects during mating attempts. Studies on orchid pollination have mainly focused on cell biology, population genetics, micromorphology, chemical analysis and gene-function studies, as well as biochemical and physiological studies on flowers. A general approach towards the understanding on orchid pollination biology, as well as in the events following pollination, by means of high throughtput techniques is lacking. The study here presented intends at contributing to the knowledge on post pollinationregulated mechanisms in the sexual deceptive orchid Ophrys fusca Link, a common bee orchid in the Mediterranean, natural occurring in Portugal. To accomplish such goal, two different approaches were assigned: a transcriptional analysis and a metabolic profiling. Transcriptomics and metabolomics were both used to gather insights on the post pollination changes occurring in Ophrys fusca labellum. To access pollination-enhanced events, two time points were considered for analysis: 2 and 4 days after pollination (DAP). Labellum transcriptional analysis allowed probing gene expression modulation of post pollination changes. The first response to pollination appears to be a stress response (2DAP) and later at 4DAP, nutrient mobilization occurs and de novo protein synthesis is induced for senescence progression. Pollination sets off proteolysis, remobilization of nutrients such as phosphate, carbon and nitrogen from labellum and deactivates energy-consuming processes (e.g. photosynthesis, photorespiration) and major metabolic pathways related to labellum upholding. Transcripts identified by microarray analysis reveal pivotal processes associated with secondary metabolism responsible for labellum traits (e.g. pigmentation, compounds emission involved in pollination), proteolysis, stress and defence, and remobilization of nutrients associated with pollination induced-senescence. Labellum transcriptional regulation seems to be mediated by non-specific stress-related pathways, disclosed by the expression of several stress- and pathogen-related transcripts (GST, antimicrobial snakin proteins,Lea5 protein, metallothioneins types 2 and 3, chitinases, PR protein, Cys proteases, RNases), until the newly protein synthesis is achieved for senescence progression. Metabolic profiling in labella extracts was focused on cuticular compounds (alkanes and alkenes), known to trigger the pseudocopulatory behaviour of male pollinators. Results show that post pollination machinery does not rely on an abrupt decrease of odour production, which is in agreement with previous reports on other Ophrys species, probably due to compounds function as part of the desiccationpreventing wax layers. Through labellum gene expression analysis, transcripts related to biosynthetic pathways of cuticular compounds, involved in Ophrys pollinator attraction, were identified: stearoyl ACP desaturases (SAD). Down regulation of these transcripts along with maintenance of odour production may indicate that correlation between RNA level and its by-products cannot be directly made. Thus, a labellum post pollination proteomics approach will allow tracking enzymes responsible for alkenes’ production, thereby giving a more comprehensive walkthrough of their regulation on pollination event. Such observations could adjoin some awareness on the genetic basis of pollinator attraction. By combining both transcriptional and metabolic profiling analysis to study post pollination events in a sexually deceptive orchid, the work here presented gives an important contribution for the understanding of this peculiar pollination system.