Avaliação das técnicas de diagnóstico viral baseadas em isolamento de dsRNA e RT-PCR, para certificação de uma colecção de clones da cv. "Negrinha de Freixo" (D.O.) de Olea europaea L.

Abstract

Estudos realizados na área da virologia com base na aplicação de testes de transmissão mecânica e sorológicos (Enzyme linked i~nosorbent assay - ELISA) em olivais do nordeste e do sul do país, revelaram níveis de infecção viral muito elevados, atingindo em alguns casos 100%. Estas técnicas de diagnóstico são morosas e menos sensíveis quando comparadas com outras desenvolvidas mais recentemente, como por exemplo as baseadas na transcrição reversa do RNA viral, seguida de amplificação por reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR). Este trabalho consiste na adaptação e aplicação de duas técnicas de diagnóstico viral a amostras provenientes da colecção de clones da cv. 'Negrinha de Freixo' de oliveira (Olea europaea L.) existente na Quinta do Valongo em Trás-os-Montes, uma baseada na análise de duplas cadeias de RNA (dsRNA) e a segunda, RT-PCR específico para Olive latent virus 1 e Tobacco necrosis virus D. A técnica RT-PCR foi previamente optimizada usando amostras provenientes de oliveiras infectadas com cada um dos vírus em análise. Isolou-se a fracção de dsRNA das plantas, a qual se desnaturou para servir de 'molde' para sintetizar o DNA complementar (cDNA). Este cDNA foi amplificado por PCR utilizando primers específicos para cada um dos genomas virais. Os resultados obtidos com o método de isolamento de dsRNA põem em causa a eficácia deste método para detecção de vírus a partir de frutos de oliveira e mostram a sua baixa sensibilidade. No caso de infecção por OLV-1 a reacção de RTPCR resultou na amplificação de um fragmento de ca 750 nt de comprimento e, no caso da infecção por TNV-D, num fragmento de ca 260 nt de comprimento. Das amostras de 161 árvores analisadas apenas uma se revelou infectada por OLV-1 e 35 infectadas por TNV-D. Dada a elevada taxa de infecção das árvores com o vírus TNV-D, foi analisada a presença do fungo Olpidium brassicae Wor. Dang, conhecido vector deste vírus em outras culturas, no solo circundante de 10 árvores, 6 das quais infectadas com TNV-D. Observou-se a presença daquele fungo em todas as amostras de solo testadas. A realização do método RT-PCR utilizando preparações de dsRNA como "molde" permitiu verificar a alta sensibilidade deste método, revelando a presença de vírus nas amostras que se tinham revelado negativas por análise das dsRNA. Este estudo permitiu mostrar a possibilidade de aplicação em larga escala, da técnica RTPCR usando como 'molde' dsRNA, possibilitando o seu uso na certificação fitossanitária de plantas de oliveira. /***Abstract - Virology studies based on mechanical inoculation and serological methods (Enzyme linked immunosorbent assay - ELISA) in olive fields from northeast and south of Portugal, showed high levels of viral infection, reaching in some cases 100%. These diagnostic techniques are time consuming and less sensitive when compared to the ones based on reverse transcription of viral RNA followed by amplification through PCR. This study concerns the adaptation and application of two viral diagnostic techniques to samples taken from a collection of olive trees clones of cv. 'Negrinha de Freixo' (Olea europaea L.) located in Quinta do Valongo, Trás-os-Montes, one based on the isolation of dsRNA, and the other, RT-PCR using specific primers for Olive latent virus 1 and Tobacco necrosis virus D. RT-PCR was previously optimized using samples from known TNV-D and OLV-1 infected olive trees. From there, dsRNA was isolated, denatured and used as template for RT-PCR. Isolation of dsRNA, from fruits of olive trees, showed to be not enough sensitive for viral detection when used as a diagnostic method by itself. RT-PCR using specific primers of OLV-1, amplified a fragment ca 750 nt and RT-PCR using specific primers of TNV-D, amplified a fragment ca 260 nt. Of the 161 samples tested, only one showed to be OLV-1 infected and 35 showed to be TNV-D infected. Due to the high levels of TNV-D infection, the presence of Olpidium brassicae Wor. Dang., a known vector of this virus in other crops, was analysed in the soil around 10 olive trees, 6 of which had tested TNV-D positive. This fungus was found in all of the soil samples. RT-PCR using dsRNA as template showed to be highly sensitive, showing infection in trees that had tested negative by the method of analysis of dsRNA. This study shows the possibility of the application in large scale of RT-PCR using dsRNA and its usefulness for sanitary certification of olive plants.