Caracterização de isolamentos virais de olea europaea L. na perspectiva de programas de selecção sanitária da oliveira

Abstract

Neste trabalho, efectuou-se a caracterização biológica e fisico-química de dois isolados virais obtidos a partir de duas árvores de Olea europae L., das cultivares Galega Vulgar e Verdeal Alentejana, do concelho de Serpa. Estas árvores foram inicialmente designadas por Gl 1 e Vr 10, respectivamente. Ambos os isolados foram obtidos por inoculação mecânica de extractos de frutos em plantas indicadoras, nas quais os sintomas causados se revelaram distintos em alguns casos. Utilizou-se a Nicotiana benthamiana Domin para propagação em larga escala, com vista à posterior purificação virai. A purificação foi feita por homogeneização em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,0, clarificação em butanol-cloroformio, seguida de dois ciclos de centrifugação diferencial e finalmente centrifugação em gradientes de densidade de sacarose. Nestes, ambos os isolados sedimentaram numa única banda, mostrando um coeficiente de sedimentação de cerca de 110 S. Observações ao microscópio electrónico de amostras virais purificadas e contrastadas negativamente, revelaram a presença de partículas isométricas, com diâmetros aproximados de 28 nm e 20 nm, respectivamente para os isolados Gl 1 e Vr 10. A análise por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida mostrou que as partículas de ambos os isolados eram constituídas por peptideos com massa molecular de 30 KDa. 0 ácido nucleico viral, isolado das partículas de Vr 10 pelo método do fenol e das partículas de Gl 1 pelo método do perclorato de sódio, foi tratado por enzimas e analisado por electroforese em gel de agarose, chegando à conclusão de que se tratava de RNA de cadeia simples. No caso do isolado Vr 10, observou-se a presença de um único tipo de molécula de RNA, com massa molecular de cerca de 1,4 x 106 Da. No caso da Gl 1 se observaram-se duas moléculas de 1,4 x 106 Da e 0,1 x 106 Da. Este segundo RNA virai poderá constituir um RNA satélite encapsidado na partícula, pois a maior parte das outras características do Gl 1 aproximam-no do Necrovirus conhecido de oliveira, o olive latent viras-1(OLV-1), que não possui esta espécie de RNA. A análise por electroforese de agarose das cadeias duplas de RNA (dsRNA), isoladas de plantas de N. benthamiana infectadas com cada um dos isolados virais, permitiu a detecção em gel de agarose de quatro bandas de dsRNA com as massas moleculares aproximadas de 2,6 x 106 Da, 1,05 x 106 Da, 0,94 x 106 Da e 0,4 x 106 Da, no caso do isolado Gl 1 e três bandas de dsRNA com as massas moleculares aproximadas de 2,7 x 106 Da, 1,1 x 106 Da e 0,9 x 106 Da no caso do isolado Vr 10. A utilização de anticorpos específicos para dois vírus de oliveira, (OLV-1) e olive latent ringspot Nepovirus (OLRV) em testes de dupla difusão em agar, permitiu observar apenas uma reacção de precipitação entre o isolado viral Gl 1 e o antisoro para o necrovirus OLV-1 (estirpe obtida em Itália), semelhante à verificada entre este vírus e o antisoro homólogo. Nenhuma reacção foi obtida entre aqueles antisoros e o Vr 10. Tomando em conjunto os resultados referidos foi identificado o isolado Gl l como uma estirpe do Necrovirus OLV-1. Contudo, as caracteristicas do isolado Vr 10 não se ajustam às dos outros vírus descritos na literatura, nomeadamente na cultura da oliveira. Sugere-se que seja designado por `olive latent mottle vírus' (virus latente do mosqueado da oliveira), enquanto prosseguem os estudos que permitam enquadrá-lo num género viral conhecido. #### - Abstract - This study concerns the biological and biochemical characterization of two virus isolates recovered from two trees of the cultivars Galega Vulgar and Verdeal Alentejana of Olea europaea L. (located in Serpa, South Portugal), that were designated Gl 1 and Vr 10. Both isolates were obtained through mechanical inoculation of olive extracts onto herbaceous indicator species where the symptoms caused were distinct. Nicotiana benthamiana plants were used as propagative species for virus purification purposes. This was done by homogenization in sodium phosphate buffer (0,1 M, pH 6,0), clarification in the presence of butanol/chloroform followed by two cycles of differential centrifugation and finally centrifugation in sucrose density gradients. In these, both isolates sedimented as a single component, with a sedimentation coefficient of ca. 110 S. Observation under the electron microscope of purified viral samples negatively stained, showed the presence of isometric particles with approximate diameters of 28 nm for Gl 1 and 20 nm for Vr 10. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis showed that particles of both isolates consisted of peptides with molecular mass of 30 KDa. Viral nucleic acid isolated from Gl 1 by dissociation using sodium perchlorate and from Vr 10 using phenol, followed by treatment with enzymes and analysis by agarose gel electrophoresis showed then to consist of single strand ribonucleic acid (RNA). In the case of Gl 1, viral RNA showed to consist of two types of molecules of molecular mass approximately, 1,4 x 106 Da and 0,1 x 106 Da. This second species, because of its small size, could represent an encapsidated RNA satellite, as most of other properties of Gl 1 suggested it to be close to a known Necrovirus of Olea europaea L., olive latent viras-1, which does not possess that RNA species. In the case of Vr 10, only one type of viral RNA was present, ca. 1,4 x 106 Da. Agarose gel electrophoresis of double-stranded (ds) RNA isolated from infected N. benthamiana, allowed for the detection, in the case of Gl 1, of four dsRNA with molecular mass ca. 2,6 x 106 Da, 1,05 x 106 Da, 0,94 x 106 Da and 0,3 x 106 Da and, in the case of Vr 10 infection, three dsRNA species with molecular mass 2,7 x 106 Da, 1,1 x 106 Da and 0,9 x 106 Da. Agar double-diffusion serology test, using antiserum for the olive viruses olive latent-1 Necrovirus and olive latent ringspot Nepovirus, showed a precipitin line between OLV-1 specific antiserum and Gl 1 isolate, identical and continuos with that formed by OLV-1 isolate when placed side by side in the same plate. Gl 1 isolate did not react with OLRV antiserum and Vr 10 isolate did not react with antiserum against OLV-1 nor OLRV. Taking into account a11 these data, Gl 1 isolate was identified as a strain of the OLV-1 Necrovirus. On the other hand, the properties of Vr 10 isolate do not match those of other viruses described in the literature, namely those infecting olive crop. As it appears to be a new virai agent, it is suggested to name it `olive latent mottle virus'.