Fisiologia de estirpes do género bacillus com propriedades antifúgicas: produção de metabolitos para protecção de produtos florestais

Abstract

Os produtos florestais estão frequentemente sujeitos a contaminações por fungos quer nas plantas, causando doenças por vezes dificilmente controláveis, quer nos produtos delas resultantes, constituindo um grave problema para a indústria da madeira e do papel. Foram objectivos deste trabalho o isolamento e a caracterização de estirpes bacterianas, capazes de inibirem o crescimento de alguns fungos filamentosos contaminantes de produtos florestais. Procedeu-se ao isolamento de bactérias a partir de tecidos vegetais saudáveis de Quercus suber e seleccionaram-se as estirpes que apresentaram potencial antifúngico. As oito estirpes que apresentaram maior actividade antifúngica foram classificadas no género Bacillus. As sequências do 16S rDNA das três estirpes seleccionadas para este estudo permitiram agrupá-las no grupo de Bacillus subtilis. Filogeneticamente uma das estirpes está mais próxima de Bacillus amylofiquefaciens e as outras duas de Bacillus subtilis. Os meios de cultura 13H1, YM e MD permitiram o crescimento destes microrganismos e a produção de compostos com actividade antifúngica. Com o objectivo de melhor poder caracterizar o crescimento dos microrganismos utilizou-se um meio de cultura definido (MD). Construiu-se uma curva de produtividade para cada uma das estirpes e determinou-se a taxa específica de crescimento máxima, a constante de saturação do substracto, o rendimento máximo teórico e o coeficiente de manutenção. As culturas destes microrganismos apresentaram recuperações do carbono próximas de 100% até valores de taxas de diluição em que toda a glucose foi metabolizada. As taxas específicas de consumo de O2 e de produção de CO2 também foram avaliadas. Aumentaram com a taxa específica de crescimento dos microrganismos, até valores de taxa específica de crescimento coincidentes com o consumo de toda a glucose disponível no meio de cultura. Para valores de taxas de diluição mais elevados, estas taxas metabólicas diminuíram e foi observado um aumento da eficiência de conversão do carbono. A formação de biomassa constituiu o processo de maior consumo de energia por parte destes microrganismos e o metabolismo de manutenção requereu maior percentagem de consumo de energia a taxas de crescimento baixas do que a taxas de crescimento mais elevadas. A taxa específica de crescimento influenciou o nível de actividade de enzimas das vias glicolítica, do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e da via das fosfopentoses. Estes Bacillus spp. produziram metabolitos com actividade antifúngica contra quinze estirpes de fungos filamentosos que contaminam produtos florestais: fungos da contaminação superficial da madeira, fungos do azulamento e fungos fitopatogénicos. Essa actividade manifestou-se quer durante o crescimento dos microrganismos quer na fase estacionária de culturas descontínuas. A pesquisa dos compostos activos produzidos mostrou que os compostos com actividade antifúngica estão presentes nas fracções mais polares das culturas. A realização de cromatografias em camada delgada das fracções activas em simultâneo com testes de actividade antifúngica permitiram determinar os Rf dos compostos activos e, utilizando cromatografia em camada preparativa, foi possível obter fracções mais purificadas destes compostos. A utilização de espectrometria de massa e de LC-MS permitiram determinar as massas dos compostos com actividade antifúngica. Os espectros de MS e de MS" mostraram agrupamentos de picos característicos de lipopéptidos cíclicos e a existência de fragmentos, correspondentes a alguns dos aminoácidos na parte peptídica dessas moléculas. A produção destes lipopéptidos esteve dependente da estirpe utilizada, do tempo de incubação e da fonte de azoto presente no meio de cultura. As culturas efectuadas na presença ácido aspártico, como fonte de azoto, revelaram maior actividade antifúngica. Foi estudada a influência da concentração de ácido aspártico e da idade da cultura através de um planeamento experimental, que permitiu verificar, dentro dos factores incluídos neste estudo, que as condições mais vantajosas, para a produção de compostos antifúngicos, produzidos por Bacillus C2, corresponderam a culturas de 8,5 dias, a 30°C, com agitação orbital de 200rpm, utilizando 5,55g11L de ácido aspártico como fonte de azoto, no meio de cultura MD. Abstract - The forest products are frequently subject to contaminations by fungi either in the plants, causing, from time to time, diseases difficult to control, or in their products, for instance in the wood, creating a serious problem in the pulp and paper industry. In this work the main aim was the isolation and characterization of bacterial strains abie to inhibit the growth of some contaminant fungi of the forest products. The bacteria used in this study were isolated from healthy Quercus suber and showed to be able to suppress fungal growth. From all the bacterial strains isolated, the eight strains presenting higher antifungal activity were classified in the genus Bacillus. The 16S rDNA sequences of the three selected strains, for this study, cluster these three Bacillus in the Bacillus subtilis group. The phylogenetic data showed that one of these strains is closer to Bacillus amyloliquefaciens and the other two strains are closer to Bacillus subtilis. The culture of the selected strains on 13H1, YM and MD made possible the growth of these microorganisms and allowed the production of metabolites that display antifungal activity. To better characterize the growth of the selected microorganisms, a defined culture medium was used (MD). A productivity curve was performed for each one of the microorganisms and the maximum growth rate, the substrate saturation constant, the maintenance coefficient and the theoretical maximum yield were evaluated. The carbon recoveries of the cultures were close to 100% when the whole glucose was used. The specific rate of consumption of O2 and the specific rate of CO2 production increased with the specific growth rate, when the whole glucose was used, for higher dilution rates, these metabolic values decreased and an increase of CCE was observed. The biomass formation is the most energy consumption process by these microorganisms and the maintenance metabolism leade to a larger energy consumption at low growth rates than to higher growth rates. The specific growth rate of the Bacillus used in this study showed to influence the level of enzymatic activities of glycolytic enzymes, TCA and PMP pathways. Bacillus strains used in this study produced metabolites with antifungal activity against fifteen filamentous fungi that contaminate forest products: wood surface contaminant fungi, bluestain fungi and phytopathogenic fungi. This activity was observed in continuous cultures, during the growth of the microorganisms, and on the stationary phase of batch cultures. The metabolites with antifungal activity are present in the most polar fractions of the cultures. TLC of these fractions in simultaneous with antifungal activity tests allowed to determine Rf of compounds and purified fractions of these metabolites where obtained by preparative chromatography. Mass spectrometry and LC-MS where used to determine the masses of the, compounds with antifungal activity. MS and MS" spectral analysis revealed characteristic peak clusters of cyclic lipopeptides and fragment ions that correspond to some amino acids on the, peptide portion. The production of these lipopeptides was dependent from the strain used, from the incubation time and from the nitrogen source present in the culture medium. The, use of aspartic acid as nitrogen source in the cultures was more effective on the production of antifungal activity than other conditions tested. An experimental design performed showed, on the conditions included in the study, that the most advantageous conditions for the, production of antifungal compounds, produced by Bacillus C2 corresponded to cultures of 8,5 days, to 30°C, with orbital agitation of 200rpm, using 5,55g11- of aspartic acid as nitrogen source, in the culture, medium MD.