Caracterização biomolecular de Olive latent Virus 1 Isolado de Olea europaea L.

Abstract

Este trabalho incidiu sobre o estudo de isolados de OLV-1 obtidos de Olea europaea L. cultivada em Portugal e em especial sobre o isolado GM6. Estudaram-se as propriedades de natureza biológica e molecular e realizou-se pela primeira vez a sequenciação do genoma completo de um isolado de OLV-1 de oliveira, procedeu-se à identificação serológica e molecular de 17 isolados e à análise da variabilidade genómica destes, e compararam-se vários métodos de diagnóstico de OLV-1 aplicáveis à cultura da oliveira. O isolado GM6 transmitiu-se mecanicamente a vários hospedeiros herbáceos nos quais produziu unicamente necroses locais. As partículas virais com cerca de 30 rim de diâmetro, têm um coeficiente de sedimentação de 111 S, a cápside proteica é constituída por péptideos com 32 kDa e rodeiam uma molécula de RNA genómico de cadeia simples e de sentido positivo com 3,7 kb. Estas propriedades são semelhantes às do OLV-1 isolado italiano, de oliveira, com o qual é serologicamente relacionado. O RNA vira) é constituído por 3702 nts e está organizado em 5 ORFs, tem capacidade para codificar 5 péptidos e apresenta duas regiões não traduzidas de 60 nts e 258 nts próximas das extremidades 5' e 3', respectivamente e ainda duas regiões intercistrónicas, uma de 5 nts entre a ORF 3 e a ORF 4 e outra de 24 nts entre a ORF 4 e a ORF 5. A ORF 1 situada na extremidade 5', codifica uma proteína com Mr estimada em 23004 (p23), e a leitura continua do codão stop 'amber', origina uma proteína parcialmente idêntica à anterior com uma M, estimada em 82484 (p82) codificada pela ORF 2. Esta proteína foi identificada como a replicase vira) (RdRP), com base na elevada identidade, superior a 90%, com as RdRp de outros necrovirus. Filogeneticamente, esta proteína encontra-se no mesmo ramo filogenético que a RdRp do OLV-1 isolado de citrino. As ORF 3 e ORF 4 codificam polipéptidos com uma M, estimada de 8051 (p8) e 6268 (p6), respectivamente. Admite-se que estes polipéptidos estejam envolvidos no movimento das partículas virais de célula para célula, com base na elevada identidade com as p8 e p6 do isolado de citrino de OLV-1, 93,2% e 100%, respectivamente, que possuem a função de facilitar o movimento virai. Na extremidade 3' do genoma está localizada a ORF 5 que codifica a proteína da cápside vira) e que tem uma Mr estimada de 29853 (p30) e mostra uma identidade de 98,5% e de 87,7%, com as homólogas relativas aos isolados de túlipa e de citrino, respectivamente. A pesquisa de regiões conservadas na proteína da cápside revelou a localização do domínio S (Shell), situado entre os aminoácidos 53 e 270 e também a respectiva região de consenso deste domínio. Nesta região, que é constituída por 26 aminoácidos entre os resíduos 135 e 160, observou-se o aminoácido leucina, na 17a posição, à semelhança do que se verifica nos outros isolados de OLV-1, mas que não se observa nos outros vírus isométricos de plantas com genoma de RNA. Para além desta sequência, foram ainda identificados quatro resíduos de ligação ao Ca2+ , dois resíduos de ácido aspártico, um de lisina e um de leucina, responsáveis pela estabilidade da estrutura quaternária da cápside proteica. O isolado vira) GM6 revelou a capacidade de ser transmitido através do solo a plantas de N. benthamiana, na ausência de vectores biológicos. Nestas circunstâncias a infecção do vírus restringiu-se à parte radical, não infectando a parte aérea da planta, como se demonstrou por testes de inoculação mecânica, DAS-ELISA e RT-PCR. Neste trabalho caracterizou-se parcialmente um grupo de 23 isolados virais obtidos de oliveira, que apresentaram características de necrovirus. Uma primeira análise por DAS-ELISA permitiu identificar 17 isolados como OLV-1 e 8 como TNV (lato sensu) elou OMMV, não tendo sido possível distinguir entre estas espécies virais por o antisoro usado em ELISA ser de muito largo espectro e por o OMMV ser serologicamente muito semelhante ao TNV-D. Estes testes permitiram também verificar a ocorrência de infecções mistas numa mesma árvore, facto que pode proporcionar a recombinação genómica e originar vírus com características comuns às espécies OLV-1 e TNV-D, como é o caso já conhecido do necrovirus OMMV. Os isolados de OLV-1 identificados por DAS-ELISA foram submetidos a testes de RT-PCR com 'primers' específicos para o OLV-1, tendo-se verificado que dois desses isolados não geraram o produto amplificado esperado, não se confirmando assim a identificação serológica inicial. Esta discrepância poderá dever-se, por exemplo, a prováveis mutações na sequência nucleotidica na zona de hibridação dos 'primers' impedindo o seu emparelhamento. Os produtos de amplificação obtidos por RT-PCR aplicados a 15 dos 17 isolados de OLV-1 de oliveira, foram sujeitos a análise de SSCP. Os padrões obtidos em gel revelaram a presença de 5 padrões electroforéticos distintos, com uma, duas ou três conformações estáveis correspondendo à presença de diferentes variantes na mesma árvore. Neste trabalho foram ainda avaliados vários métodos para o diagnóstico virai, principalmente de OLV-1, directamente de tecidos de oliveira. A análise das dsRNA não constituiu, nas nossas condições, um método eficaz, pois os resultados obtidos foram sempre negativos, apesar de se saber, por outras vias (por exemplo, inoculação mecânica seguida de purificação e caracterização virai), que algumas das árvores analisadas estavam infectadas. No entanto, a utilização destas mesmas preparações de dsRNA como molde em reacções de RT-PCR, utilizando 'primers' específicos para o OLV-1, originaram resultados positivos demonstrando que os testes de RT-PCR possuem uma maior sensibilidade. A detecção de OLV-1 foi eficaz tanto aplicada a amostras provenientes de ramos como de frutos, embora o produto final da reacção de amplificação fosse menos concentrado nas amostras obtidas de frutos do que de ramos. Os testes de RT-PCR 'single-step' possibilitaram a detecção de OLV-1 em plantas de N. benthamiana infectadas e o RT-PCR 'single-step multiplex' foi optimizado para possibilitar a detecção simultânea dos 3 necrovirus que infectam a oliveira. Esta modalidade tem a vantagem de reduzir o tempo necessário para o diagnóstico e o custo em reagentes e permitiu-nos diagnosticar infecções mistas e simples dos necrovirus que infectam a oliveira em Portugal. O elevado nível de infecções virais que ocorrem nos olivais Portugueses, já verificada em outros estudos, e por outro lado a elevada sensibilidade e especificidade dos RT-PCR multiplex, demonstram claramente a importância destes e considera-se imprescindível a sua aplicação em Programas nacionais de melhoramento, de selecção e de certificação sanitária da oliveira, como exigido por legislação da União Europeia Directiva 93/48 de 23-06-93, Conformitas Agraria Communitatis (CAC). /Abstract - This work involves the study of OLV-1 isolates obtained from Olea europaea L. growing in Portugal, in particular the GM6 isolate. The biological and molecular properties were studied and the genome of an OLV-1 olive isolate was fully sequenced for the first time. Additionally, 17 different OLV-1 isolates were serological and molecularly identified and the genomic variability among them was analysed. Different methods for OLV-1 diagnoses applied to olive crop were compared and optimized for practical purposes. The GM6 isolate was mechanically transmitted to several herbaceous hosts where it produced only local necrotic lesions. Virus particles with about 30 nm in diameter, sedimented as a single component with 111 S, the coat protein is made up 32 kDa peptide subunits that surrounded a positive single strand molecule of genomic RNA with ca. 3.7 kb. The properties of this isolate are identical to that of an Italian OLV-1 isolate obtained from the Italian olives with which it is serologically related. The viral RNA is 3702 nucleotides long, is organized in 5 ORFs with the coding capacity for 5 peptides, shows two non coding regions with 60 and 258 nts in the 3' and 5' ends, respectively, and also two small inter cistronic regions, one with 5 nts between ORF 3 and ORF 4 and another with 24 nts between ORF 4 and ORF 5. The ORF 1 located in the 5' end encodes a peptide with an estimated Mr of 23004 (p23), the read through of its amber termination codon allows the translation of the ORF 2 that encodes a protein with an estimated Mr of 82484 (p82). This protein was identified as the viral replicase (RdRp) based on the high identity, over 90%, with that of other necrovirus and the phylogenetic analysis showed that it is in the same branch as that of OLV-1 citrus isolate. ORF 3 and ORF 4 encoded polypeptides with an estimated M, of 8051 (p8) and 6268 (p6), respectively, are likely to be involved in the cell-to-cell movement of virus particles. These polypeptides share a high percentage of identity with those of OLV-1 citrus isolate, 93.2% and 100%, respectively. In the 3' end of viral genome is located the ORF 5, that encodes the viral coat protein with an estimated M, of 29853 (p30), showing an identity of 98.5% and 87.7% with that of the tulip and citrus isolates. A domain search of the coat protein sequence revealed the S domain located between the 53 and 270 amino acid residue as well as the consensus pattern of that domain. In this consensus pattern constituted by the 26 amino acids located between the 135 and 160 residues, is the amino acid leucine at position 17th, which had not been considered in the described pattern. This leucine is conserved in all OLV-1 isolates in the 17th position of that sequence, but is not found in the consensus pattern of the other small icosahedral plant viroses so far compared. In the S domain were also found four sites (two for aspartic acid, one for lysine and one for asparagine) likely to be involved in Ca2+ binding, that confer the stability of the protein quaternary structure. The GM6 isolate showed the ability to be transmitted trough the soil to N. benthamiana plants in the absence of biological vectors. The virus infection was limited to the plant root system, as demonstrated by mechanical transmission, DAS-ELISA and RT-PCR tests. Additionally, in this work 23 viral isolates obtained from olive, showing necrovirus properties were partially characterized. Application of DAS-ELISA test were identified 17 isolates as OLV-1 and 8 as TNV (lato sensu) and/or OMMV. It was not possible to distinguish between these species because the antiserum used was of broad range and because OMMV is serologically very Glose to TNV-D. This test detected mixed infections in the same tree, which permits the occurrence of the genomic recombination and thus originating new viral species with characteristics of the both OLV-1 and TNV-D, as is the case of OMMV. The OLV-1 isolates identified by ELISA tests were further analysed by RT-PCR with primers specific for OLV-1. Reactions involving two of those isolates did not show the expected amplified product not confirming the previousiy serological identification. Such discrepancy may be due, for example, to mutations in the vital genomic sequence where the primers hybridize, thus preventing further amplification. The amplified products obtained from RT-PCR application to 15 OLV-1 isolates were subjected to SSCP analysis. The resulting electrophoretic profiles, revealed the presence of 5 different patterns, with one, two or three different conformations. In this work several methods for viral diagnosis, mainly OLV-1, using olive tissues were evaluated. The dsRNA analysis, in our experimental conditions, did was not an efficient method for olive virus diagnosis. The results obtained were always negative, although it was known, that some trees tested by other methods (for example, by mechanical transmission, followed by purification and viral characterization) were infected. However, the use of the same dsRNA preparations as template in RT-PCR reactions with the OLV-1 diagnostic primers showed positive results thus revealing the high sensitivity of the RT-PCR tests. The OLV-1 detection was efficient in stems as well as in fruits, but the reaction final amplified product was less concentrated when working with fruit samples than with stems. The RT-PCR single-step tests detected OLV-1 in N. benthamiana infected plants very easily but preference was given to optimizing the RT-PCR single-step multiplex to allow the simultaneous detection of the 3 necroviruses. This method saves time and reagent costs and allows the detection of mixed and simple infections in olive trees. The high level of vital infections that occurs in Portuguese olive orchards observed in previous studies, and the high specificity and sensitivity of the RT-PCR multiplex, show the great importance of these tests and clearly show the relevance of their implementation in national Programmes for breeding, selection and sanitary certification of olive cultivars, as required by European Union legislation, as Directive 93/48 from23-06-93, Conformitas Agraria Comunitatis (CAC).