Salivary proteomics as a tool to understand ingestive behavior: an experimental study in sheep (Ovis aries), goat (Capra hircus) and mice (Mus musculus)

Abstract

The oral cavity is the part of the animal internal medium that first comes into contact with food. Numerous chemical and mechanical receptors in the mouth respond to the food chemical and physical properties and monitor the changes during processing. This leads; to central perception of taste and texture of food, which, together with odor, are important determinants in the decision of to ingest or not. Saliva plays an important role in the perception of taste and texture sensations. Its composition can modulate food perception and, simultaneously, be modulated by the type of diet. This thesis is focused on the study of the role of salivary proteins on ingestive behavior. Tannins are used as a modal to access changes in salivary protein profile induced by dietary compounds. These plant secondary metabolites produce aversive taste/oral sensations influencing animal diet choices. The levels of dietary tannins tolerated vary according to the physiological mechanisms that animals possess to avoid their potential negative effects. Saliva, and more particularly salivary proteins, has been pointed as a defense mechanism against tannins. Three animal species were studied: sheep, goat and mice. The first two species are ruminant species and present similar digestive characteristics, but differ between them in the levels of dietary tannins tolerated. Mice, on the other hand, represent a rodent mammalian specie with different digestive characteristics. We have studied the effect of tannins on mice salivary gland histomorphology (chapter 2) since these are the sites of salivary protein production. Both condensed and hydrolysable tannins produced major effects in the acinar structures, with condensed tannins having a stronger effect. The similarities between these effects and the ones produced by isoproterenol suggested that tannins act through activation of sympathetic nervous system. The effects of quebracho tannin and tannic acid on mice whole saliva protein composition were studied by comparing the SDS-PAGE profile of control animals to the ones from animas fed with these compounds during 10 days (chapter 3). Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) data were used to identify salivary proteins. One isoform of salivary amylase was observed to increase in response to both types of tannins. Despite a considerable number of studies on mice salivary glands and saliva, a proteome of mice whole saliva was not, at our knowledge, characterized to date. In chapter 4 we used two-dimensional electrophoresis coupled to MALDI-TOF MS for this purpose. A total of 26 proteins were identified. The effects of the ingestion of quebracho tannin for a period of ten days were studied in the salivary protein fraction, which does not precipitate tannins. The expression leveis of one isoform of alpha amylase and of an unidentified protein were observed to increase, whereas acidic mammalian chitinase and Muc10 decreased. Additionally, two protein spots were induced, that were not identified by MS, but, based on their staining characteristics, we suggest them to be proline-rich proteins, Sheep and goat parotid saliva proteomes were characterized and compared, and total of 40 parotid salivary proteins were identified, with differences between the two species being reported (chapters 5 and 6). , Two-dimensional electrophoretic protein saliva maps of animals in control diets and after 10 days quebracho tannin consumption were compared (chapter 6). Changes in salivary protein expression levels induced by tannins were observed, some of which are common to sheep and goats and others specific of each species. Altogether the results suggest that salivary proteome study can be important in understanding feeding behavior and that proteome is influenced in the short-medium terra by diet composition. Although differences among mice, sheep and goats exist, in response to tannin ingestion, a common feature to the three species is the increase in the expression levels of proteins usually increased in stress situations. This, together with the histomorphometric data, which point to an action of tannins in sympathetic nervous system, suggests that the mechanisms involved in salivary protein regulation by tannins may be related to a "stress response" imposed by these compounds. /RESUMO - A cavidade oral é o local de primeiro contacto entre o alimento e o ambiente interno do animal. Numerosos receptores químicos e mecânicos, presentes na boca, respondem às propriedades químicas e físicas dos alimentos e monitorizam as alterações durante o seu processamento. Isto tem como consequência a percepção do gosto e textura dos alimentos, os quais em conjunto com o olfacto, são determinantes na decisão de ingerir. A saliva desempenha um papel de extrema importância neste processo, pois a sua composição pode modular a percepção dos alimentos, e, em simultâneo, ser modulada pelo tipo de dieta. A presente tese tem como objectivo o estudo do papel das proteínas salivares no comportamento ingestivo. Para avaliar as alterações na secreção de proteínas salivares induzidas por compostos presentes na dieta utilizaram-se três tipos de taninos: ácido tânico, chestnut (taninos hidrolisáveis) e quebracho (taninos condensados). Estes metabolitos secundários das plantas produzem sensações gustativas/orais aversivas que influenciam a escolha da dieta, por parte dos animais. Os níveis de taninos, presentes na dieta, tolerados pelas diferentes espécies animais variam de acordo com os mecanismos fisiológicos que cada u ma possui para evitar potenciais efeitos negativos. A saliva, e mais especificamente as proteínas salivares, têm sido apontadas como componentes de mecanismos de defesa que contrariam os efeitos dos taninos. Para avaliar a importância da saliva no comportamento ingestivo, e mais especificamente no consumo desses compostos, foram estudadas três espécies: ovelhas (Ovis arfes), cabras (Capra hircus) e murganhos (Mus musculus). As duas primeiras apresentam características digestivas semelhantes, mas diferem entre elas nos níveis de taninos que toleram; os murganhos, por outro lado, representam uma espécie de mamíferos com diferentes características digestivas. No capitulo 2 estudaram-se os efeitos dos taninos ao nível da histomorfologia das glândulas salivares de murganhos. É conhecido que, em roedores de laboratório, proteínas salivares, como as proteínas ricas em prolina (PRPs), são induzidas por agonistas do sistema nervoso simpático (ex. isoproterenol), e que essa indução está inter-relacionada com um aumento do tamanho das estruturas atinares das glândulas parótidas e submandibulares. 0 efeito do consumo de taninos apresenta semelhanças com o efeito provocado pelo tratamento com isoproterenol, no que diz respeito a um aumento da massa glandular e à indução de PRPs. De modo a estudar os efeitos dos taninos, a nível da histomorfologia das glândulas salivares, murganhos foram submetidos a dietas com três taninos pertencentes a diferentes classes estruturais (ácido tânico, chestnut e quebracho), ou injectados com isoproterenol, durante dez dias. 0 tamanho dos ácinos das glândulas salivares, parótidas e submandibulares, aumentou significativamente, tendo sido esse aumento maior para as glândulas parótidas, comparativamente às glândulas submandibulares, e maior para os animais que consumiram quebracho, comparativamente com os outros tipos de taninos. 0 tratamento com qualquer um dos três tipos de taninos também resultou num aumento significativo do tamanho dos ácinos das gandulas sublinguais, ao contrário do tratamento com isoproterenol, que não produziu alterações significativas nestas estruturas. Os resultados obtidos por nós estão de acordo com outros estudos que sugerem que os taninos actuam a nível do sistema nervoso simpático, mais concretamente ao nível dos receptores beta-adrenérgicos. No entanto, e devido à observação de efeitos produzidos ao nível das glândulas sublinguais, não são de excluir mecanismos adicionais da acção dos taninos. Para além disso, são apresentadas evidências de que os efeitos produzidos pelos taninos dependem da estrutura destes compostos, e é possível que os murganhos necessitem de produzir uma maior quantidade de proteínas salivares, como defesa contra a acção de taninos condensados, comparativamente a taninos hidrolisáveis. Presentemente sabe-se que, dois grupos de proteínas salivares, histatinas e proteínas ricas em prolina, apresentam uma elevada afinidade para taninos, diminuindo a actividade biológica destes compostos. A possibilidade de existirem outras proteínas salivares com funções de defesa contra taninos é desconhecida. No capítulo 3 caracterizaram-se e compararam-se os perfis proteicos da saliva mista de murganhos submetidos a três tipos de dieta: controlo, com a incorporação de taninos hidrolisáveis (5% ácido tânico) ou coma incorporação de taninos condensados (5% quebracho). As proteínas foram separadas de acordo com as suas massas moleculares, por electroforese em gel de poliacrilamida Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE), e analisadas utilizado um espectrómetro de massa com ionização do tipo MALDI (Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization) associado a um analisador de massas, do tipo "tempo de voo", TOF (Time of Flight). A identificação das proteínas presentes nas bandas isoladas foi feita através do método "Peptide Mass Fingerprinting" (PMF). Uma vez que as proteínas mais abundantes dificultam a observação e identificação de proteínas com menores níveis de expressão, recorreu-se à centrifugação para remoção das proteínas precipitadas pelos taninos. Foi possível identificar dez proteínas salivares diferentes, algumas das quais apresentando diferentes isoformas. A adição de taninos à dieta provocou alterações no perfil proteico da saliva. Uma isoforma de alfa-amilase foi sobre-expressa em consequência do consumo de ambos os tipos de taninos. Por outro lado, a proteína aldeído redutase foi identificada apenas no grupo que consumiu quebracho. Apesar do número considerável de estudos realizados com glândulas salivares e saliva de roedores de laboratório, a caracterização do proteoma da saliva destas espécies não se encontra ainda descrita. No capítulo 4 pretendeu-se caracterizar o proteoma da saliva mista de murganho, recorrendo à separação proteica por electroforese bi-dimensional, seguida da identificação das proteínas por PMF, e avaliação das alterações provocadas pelo consumo de taninos na composição proteica da saliva que não é precipitada por esses compostos.