http://hdl.handle.net/10174/32 2026-04-03T18:57:42Z http://hdl.handle.net/10174/41570 Title: PHOTODYNAMIC THERAPY INDUCED OXIDATIVE STRESS IN OCULAR MELANOMA CELLS Authors: Guerra Guimarães, Tarcísio; Mamede, Fabrício; Cardoso, Karla; Pereira, Nelson; Pineiro, Marta; Pinho e Melo, Teresa; Alexandre, Nuno; Botelho, Maria Filomena; Laranjo, Mafalda Abstract: Purpose: To assess the oxidative stress induced by photodynamic therapy (PDT) using new photosensitizers the dihydroxymethyl ring-fused chlorin (PS1) and dihydroxymethyl-Pt(II) ring-fused chlorin (PS2), in ocular melanoma cells. Methods: Ocular melanoma cell line MP-41 was cultured and incubated with 100 and 500 nM concentrations of the photosensitizers for 24 hours. After renewing the culture medium, the cells were irradiated with visible light (λ>570nm, 10J). To study the role of singlet oxygen and hydroxyl radicals, the cells were treated with PDT in the presence of sodium azide (5mM) and D-mannitol (40mM). Intracellular superoxide and peroxide levels were measured using DHE (5μM) and DCF-HA (5μM), respectively, followed by spectrophotometric and fluorimetric analyses. Results: Inhibition of singlet oxygen increased metabolic activity in cells treated with 100 nM PS1 and PS2 from 48.4±13.6 to 118.8±4.7 and from 56.4±16.8 to 102.0±3.6, respectively. With 500 nM PS1 and PS2 from 0,77±0,2 to 8,3±3,29 and from 2,3±1,7 to 12,2±1,6, respectively. The presence of a superoxide radical scavenger led to metabolic activities with 100 nM PS1 and PS2 from 48,4±13,6 to 67,3±19,5 and from 56,4±15,6 to 75,5±13,2, respectively. With 500 nM PS1 and PS2 from 0,77±0,2 to 6,3±4,5 and from 2,3±1,7 to 17,4±8,3, respectively. Conclusions: Reactive Oxygen Species (ROS) generation is key in PDT-induced cell death, with singlet oxygen playing a predominant role in the type II photodynamic process, as demonstrated by the chlorins' efficacy in ocular melanoma cells. The reduced peroxide and superoxide levels suggest singlet oxygen's significant generation, though type I reactions may also be involved. Key-words: ocular melanoma, PDT, photosensitizers, ROS. 2025-03-26T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10174/41542 Title: NUEVAS CLORINAS COMO AGENTES FOTODINÁMICOS PROMETEDORES EN CÉLULAS DE MELANOMA OCULAR HUMANO, CANINO Y FELINO Authors: Guerra Guimarães, Tarcísio; Tralhão, Pedro; Menezes Cardoso, Karla; Marto, Miguel; Teixo, Ricardo; Serambeque, Beatriz; Pereira, Nelson; Pineiro, Marta; Pinho e Melo, Teresa; Alexandre, Nuno; Filomena Botelho, Maria; Laranjo, Mafalda Abstract: Introducción Los melanomas oculares son neoplasias malignas de origen melanocítico que afectan con frecuencia a humanos, perros y gatos1. Hay varias opciones de tratamiento disponibles, sin embargo, el desarrollo de nuevas terapias conservadoras es de suma importancia, ya que la enucleación es un procedimiento muy agresivo2. La terapia fotodinámica (PDT) es un tratamiento conservador que genera especies reactivas de oxígeno (ROS), provocando una toxicidad selectiva irreversible y como resultado, la muerte de las células neoplásicas por apoptosis, necrosis y autofagia3,4. El fotosensibilizador, la luz visible y el oxígeno son los tres componentes vitales no tóxicos de la reacción fotodinámica3,4. De hecho, el fotosensibilizante se considera el factor más importante. Así, varios centros de investigación tienen como objetivo estudiar y desarrollar nuevos fotosensibilizadores con las características idóneas para el tratamiento del cáncer4. Objetivos Evaluar la citotoxicidad inducida por la PDT basada en fotosensibilizadores (clorinas fusionadas en anillo) desarrollado recientemente, en células de melanoma ocular humano, canino y felino. Material y métodos La línea celular de melanoma ocular humana MP-41, un cultivo de células primarias de melanoma ocular canino y un cultivo de células primarias de melanoma ocular felino, se sometieron a fotosensibilizadores (PS1-derivado dihidroximetílico de 4,5,6,7-tetrahidropirazolo[1,5-a]piridina fusionado con tetrafenilcloro, PS2-derivado de ácido dicarboxílico de 4,5,6,7-tetrahidropirazolo[1,5-a]piridina fusionado con tetrafenilclorina, PS3-complejo de platino (II) de derivado de 4,5,6,7-tetrahidropirazolo[1,5-a]piridina dihidroximetilo fusionado con tetrafenilcloro, PS4-derivado diácido carboxílico de colina de Pt (II) fusionado con anillo de 4,5,6,7-tetrahidropirazolo[1,5-a]piridina) a concentraciones entre 0.5-1000 nM durante 24 horas. Las células se irradiaron con luz visible (ƛ>570 nm) con un total de 10 J de energía. Los grupos control incluyeron: células no tratadas y células sometidas únicamente al vehículo de administración (DMSO). La evaluación de citotoxicidad (MTT) se realizó 24 horas después de la PDT y permitió el análisis del valor de la mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50). Resultados El compuesto más activo fue clorina PS1, con un valor IC50 de 95.1 nM. PS3 también mostró una actividad fotodinámica prometedora con un valor IC50 de 114.8 nM en células de melanoma ocular humano. Estas clorinas también mostraron resultados muy satisfactorios en células caninas, con una IC50 de 0.6 nM para PS1 y 2.2 nM para PS3.También se obtuvo alta actividad a bajas concentraciones con los fotosensibilizadores PS1 y PS3 en células de melanoma ocular felino, con IC50 de 10.8 nM y 41.2 nM, respectivamente. Los fotosensibilizadores PS2 y PS4 fueron menos eficaces en todas las células de melanoma ocular.Discusión y conclusiones Los melanomas oculares tienen tasas de respuesta variables a los tratamientos conservadores1,3. La terapia fotodinámica es una modalidad en evolución para el tratamiento de diversas enfermedades, incluidas las neoplasias oculares2,4. El desarrollo de nuevos compuestos es fundamental para la optimización de los tratamientos fotodinámicos3,5. Los nuevos fotosensibilizadores mostraron buenas propiedades fotodinámicas en células de melanoma ocular en las especies estudiadas. El tratamiento con PDT indujo citotoxicidad 24 horas después del tratamiento. Los valores de IC50 obtenidos con PDT indicaron una alta actividad en muy bajas concentraciones de los nuevos fotosensibilizadores en el rango nanomolar, en células de melanoma ocular humano, canino y felino. Futuros estudios deberían realizarse para valorar el posible uso clínico de estas moléculas y sus posibles secuelas oculares en pacientes. Referencias 1. Guimarães TG, Marto CM, Cardoso KM, Alexandre N, Botelho MF, Laranjo M. Evaluation of eye melanoma treatments in rabbits: A systematic review. Lab Anim. Published online September 9, 2021:002367722110393. 2. Guimarães TG, Cardoso KM, Tralhão P, et al. Current Therapeutics and Future Perspectives to Ocular Melanocytic Neoplasms in Dogs and Cats. Bioengineering. 2021;8(12):225. 3. Laranjo M, Aguiar MC, Pereira NAM, et al. Platinum(II) ring-fused chlorins as efficient theranostic agents: Dyes for tumor-imaging and photodynamic therapy of cancer. Eur J Med Chem. 2020;200:112468. 4. Guimarães TG, Cardoso KM, Marto CM, et al. Oncological Applications of Photodynamic Therapy in Dogs and Cats. Appl Sci 2022, Vol 12. 2022;12(23):12276. 5. Pereira NAMM, Laranjo M, Pina J, et al. Advances on photodynamic therapy of melanoma through novel ring-fused 5,15-diphenylchlorins. Eur J Med Chem. 2018;146:395-408. 2023-02-24T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10174/41539 Title: EFEITO ANTIMICROBIANO DA TERAPIA FOTODINÂMICA EM LESÃO CUTÂNEA NUM CÃO: RELATO DE CASO Authors: Menezes Cardoso, Karla; Guerra Guimarães, Tarcísio; Alexandre, Nuno Abstract: Introdução: A terapia fotodinâmica (PDT) é uma abordagem terapêutica que envolve a interação de três componentes atóxicos isoladamente: fotossensibilizador, luz e oxigênio molecular1. Este processo consiste na administração de um fotossensibilizador, seguido pela irradiação com luz de comprimento de onda específico, resultando na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) capazes de induzir efeitos citotóxicos e antimicrobianos1,2. A PDT na oncologia é utilizada para o tratamento de diferentes neoplasias, demonstrando alta seletividade para células malignas1. Além disso, em contextos antimicrobianos, a PDT tem se destacado como uma alternativa promissora no tratamento de infecções, em diferentes condições clínicas. Este trabalho descreve um caso clínico de um cão com lesão cutânea infectada, no qual a PDT foi aplicada, destacando não apenas seus efeitos antimicrobianos, mas também o potencial terapêutico da técnica como uma alternativa no tratamento de lesões cutâneas infectadas na prática veterinária. Descrição do caso clínico: Um cão macho, de 11 anos e sem raça definida, foi referenciado para tratamento com PDT devido a uma lesão cutânea inflamatória, exsudativa, fétida em membro posterior e que não respondeu a diversos tratamentos antimicrobianos. Em seu histórico pregresso, consta a realização de amputação de um dígito devido a trauma, com a análise histológica revelando lesão pioranulomatosa. A cultura cutânea e o antibiograma revelaram uma infecção mista por Pseudomonas spp. e Candida albicans, sem sensibilidade a qualquer antimicrobiano testado. Embora foi identificada um antimicrobiano como único fármaco com ação (Sensível aumentando exposição), tendo o mesmo sido previamente utilizada no tratamento, embora sem sucesso suficiente. Diante do quadro de resistência terapêutica antimicrobiana, a PDT foi indicada. Inicialmente, a lesão foi limpa com solução salina estéril e em seguida, aplicou-se creme de 5-ALA (20%), cobrindo toda a extensão da ferida, 4 horas antes da irradiação. A lesão foi irradiada com LED vermelho (635 nm), com total de energia de 100 J. Após a sessão da PDT, foi recomendado o uso do colar protetor e a manutenção do animal em um ambiente domiciliar limpo, restrito e controlado. Resultados: O acompanhamento clínico pós-PDT foi realizada 7 dias após a sessão terapêutica. Observou redução significativa do exsudato purulento, do odor e melhora dos sinais de inflamação. Foi sugerida a continuidade do tratamento com sessões adicionais de PDT, mas, devido à recuperação clínica do animal, os tutores optaram por não prosseguir com outras sessões, sendo recomendado ainda o seguimento periódico na clínica de referência. Conclusão: Este caso demonstra que a PDT representa uma alternativa eficaz e segura no tratamento de lesões cutâneas infectadas em cães, especialmente em casos refratários a antibioticoterapia. O efeito antimicrobiano observado reforça o potencial da PDT como adjuvante no manejo de infecções resistentes, além de contribuir para o processo de cicatrização. Embora sejam necessárias padronização dos protocolos e avaliar os diferentes tipos de lesões e agentes infecciosos, os resultados apresentados indicam que a PDT pode desempenhar um papel promissor na terapia antimicrobiana na medicina veterinária. Bibliografia 1Guimarães, T.G., Cardoso, K.M., Tralhão, P., Marto, C. M., Alexandre, N., Botelho, M. F., & Laranjo, M. (2021). Current Therapeutics and Future Perspectives to Ocular Melanocytic Neoplasms in Dogs and Cats. Bioengineering, 8(12), 225. 2Maliszewska, I., & Zdubek, A. (2025). Assessing 5-Aminolevulinic Acid as a Natural Biocide Precursor for Light-Activated Eradication of Pseudomonas spp. International Journal of Molecular Sciences, 26(15), 7153. 3Wardlaw, J. L., Sullivan, T. J., Lux, C. N., & Austin, F. W. (2012). Photodynamic therapy against common bacteria causing wound and skin infections. The Veterinary Journal, 192(3), 374-377. 2025-10-09T23:00:00Z http://hdl.handle.net/10174/41538 Title: Comparação entre ultrassonografia e exame histológico para identificação de melanomas oculares em modelo ortotópico Authors: Guerra Guimarães, Tarcísio; Menezes Cardoso, Karla; Cardoso, Nuno; Gama, João; Caramelo, Francisco; Pereira, Nelson; Pineiro, Marta; Pinho e Melo, Teresa; Alexandre, Nuno; Laranjo, Mafalda; Wouk, António Filipe Abstract: Introdução: A ecografia ocular é um exame essencial no diagnóstico de melanomas intraoculares, sendo uma técnica complementar, rápida e segura, que pode ser realizada em ambulatório1. Ferramentas diagnósticas não invasivas é indispensável para mapear com precisão a extensão do melanoma, especialmente diante de opacificação dos meios transparentes, orientando a decisão sobre tratamentos conservadores ou exérese ocular2. Tumores grandes ou com extensão extraescleral, inelegíveis para terapias conservadoras, podem ser identificados pela ecografia ocular. O estudo objetivou realizar ecografia ocular em modelos ortotópicos de melanoma para mapear sua arquitetura e correlacioná-la com achados histológicos. Métodos: Utilizou dezoito olhos de ratos RNU atímicos preservados em formol. Estes foram submetidos à ecografia utilizando uma sonda linear de 7.0-18.0 MHz, em modo B. Os olhos foram fixados na região da glândula de Harder ou na membrana nictitante com uma pinça mosquito e envolvidos em uma bolsa de látex com solução fisiológica. Após o exame, foram novamente imersos em formol e encaminhados para exame histológico, com coloração por hematoxilina e eosina (H&E) para análise comparativa das imagens. Resultados: A técnica de imersão do olho em meio líquido otimizou as imagens ecográficas, permitindo identificar o melanoma intraocular, visualizado como uma região hiperecóica e heterogênea. O estudo permitiu a análise da arquitetura do melanoma ocular e a comparação entre imagens ecográficas e histologia, revelando o desenvolvimento do melanoma na câmara vítrea, retina/esclera, nervo óptico e área extraescleral. Conclusão: A concordância dos exames ecográficos e histológico foram clinicamente adequadas para identificar o melanoma ocular em modelos ortotópicos. Estudo aprovado pela Comissão de Uso Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra (ORBEA 03/2018) e conduzido de acordo com a National Institutes of Health's Guide to the Care and use of Laboratory Animals e Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) e tiveram em conta a política dos os 3R's (do inglês, Replacement, Reduction e Refinement) das boas práticas em animais de laboratório. Financiamento: O CIBB é financiado por Fundos Nacionais via FCT (Fundação para a Ciência e Tecnologia) através dos Projetos Estratégicos UID/NEU/04539/2019, UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, e pelo COMPETE- FEDER (POCI-01-0145 -FEDER-007440). Bibliografia 1Gelatt, K. N., Ben-Shlomo, G., Gilger, B. C., Hendrix, D. V., Kern, T. J., & Plummer, C. E. (Eds.). (2021). Veterinary ophthalmology. John Wiley & Sons. 2Dahlstrand, U., Merdasa, A., Hult, J., Albinsson, J., Cinthio, M., Sheikh, R., & Malmsjö, M. (2021). Photoacoustic Imaging of Enucleated Eyes from Patients with Uveal Melanoma can Reveal Extrascleral Growth. 2023-10-13T23:00:00Z