GLOBOWARNING - Mitigation of Globodera spp. outbreaks in Portugal through an innovative early nano-detection system and biocontrol

Abstract

Potato cyst nematodes (PCN), Globodera rostochiensis and G. pallida, are quarantine organisms which are subjected to stringent regulatory measures when detected. The incidence of PCN in Portugal is quite high and both species are present in all regions. Detections were mostly due to G. rostochiensis, but recently the situation has reversed. The overuse of potato cultivars resistant to G. rostochiensis led to a decline of this species population densities, but had no effect on G. pallida, which continued its reproduction without restrictions, since it doesn’t have effective resistant cultivars, being now the most detected species. Thus, breeding of commercially attractive cultivars targeting resistance to G. pallida (with different R-genes), should be a priority. Aiming a rapid detection, a Loop-mediated-isothermal-amplification (LAMP) G. pallida specific assay was developed. The primers designed for LAMP amplification specifically detected G. pallida, even in samples mixed with other species. Because LAMP requires cheaper equipment due to its isothermal amplification and all steps are conducted within one reaction-tube, it clearly holds potential for on-site detections. Modern agriculture uses sensor to provide accurate data on crop growth. Therefore, specific DNA-probe and PCR-primers were designed to be used in a magnetoresistive-biosensing-device developed at INESC-MN to detect G. pallida. The device receives the target PCR-products (further labelled with magnetic-nanoparticles), which hybridize with the probe immobilized on the sensor surface, being detected due to a variation in the electrical resistance of the sensor. To improve the on-site detection, the combination of the magnetoresistive-biosensing-device with an easy DNA extraction method (FTA-cards) and a rapid DNA isothermal-amplification (LAMP) was tested. These three technologies allowed the detection of G. pallida with a detection limit of one juvenile, even when mixed with other species. FTA-LAMP based biosensors show great potential for rapid in-field detections or at border phytosanitary inspection. Thus, this work provides insights for a new strategy to construct advanced devices for in-field diagnostics of plant pests/pathogens; - GLOBOWARNING - MITIGAÇÃO DE SURTOS DE GLOBODERA Spp. EM PORTUGAL ATRAVÉS DE UM SISTEMA INOVADOR DE NANO-DETEÇÃO PRECOCE E BIOCONTROLO RESUMO: Os nemátodos-de-quisto da batateira (NQB), Globodera rostochiensis e G. pallida, são organismos de quarentena, sujeitos a medidas regulatórias quando são detetados. A incidência de NQB em Portugal é bastante elevada, estando já presentes em todas as regiões. As deteções eram principalmente de G. rostochiensis, mas recentemente a situação alterou-se. A utilização de cultivares de batata resistentes a G. rostochiensis levou ao seu controlo populacional, não afetando G. pallida, que continuou a reproduzir-se por não haver cultivares totalmente resistentes a esta espécie, sendo agora a espécie mais detetada. Assim, o melhoramento de cultivares comercialmente atraentes e resistentes a G. pallida (com diferentes R-genes) deve ser prioritário. Ambicionando uma rápida deteção, foi desenvolvido um método de amplificação isotérmica de DNA (LAMP) para G. pallida. Os primers-LAMP desenhados detetaram especificamente G. pallida, mesmo em amostras com juvenis de outras espécies. Como o LAMP requer equipamentos menos dispendiosos, devido à amplificação isotérmica, e as etapas poderem ser conduzidas num único tubo, possui grande potencial para deteções in loco. Na agricultura moderna já se utilizam sensores para obter dados precisos sobre o desenvolvimento das culturas. Assim, foram desenhados primers-PCR e uma sonda, específicos para G. pallida, para serem testados num protótipo com biossensores-magnetorresistivos, desenvolvido no INESC-MN. Neste dispositivo, os produtos-PCR (posteriormente marcados com nanopartículas-magnéticas), hibridam com a sonda imobilizada na superfície do sensor, sendo detetados devido a uma variação na resistência elétrica do sensor. Para aperfeiçoar a deteção in loco de G. pallida, foi testada a combinação da utilização de cartões FTA para extração de DNA, com o método LAMP e o protótipo do INESC-MN. Estas tecnologias permitiram a deteção de G. pallida mesmo em amostras com um juvenil ou em misturas com outras espécies. Os biossensores associados com FTA-LAMP mostram-se promissores para deteções no campo ou nos postos de controlo de inspeção fitossanitária. Este trabalho fornece assim novas estratégias para diagnóstico in loco de pragas/doenças das plantas.