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http://hdl.handle.net/10174/20956
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Title: | Exploring alternative oxidase (AOX) as a functional marker candidate for efficient somatic embryogenesis in Daucus carota L. |
Authors: | Frederico, António Miguel da Costa Magriço e |
Advisors: | Peixe, Augusto António Vieira Fevereiro, Pedro Manuel Salema Baena-González, Elena |
Keywords: | Daucus Embriogénese somática Linha celular Oxidase alternativa Local polimórfico Daucus Somatic embryogenesis Cell line Alternative oxidase Polymorphic site |
Issue Date: | 24-Mar-2017 |
Publisher: | Universidade de Évora |
Abstract: | A embriogénese somática é o mais conhecido exemplo de reprogramação celular.
Daucus carota L. foi a primeira espécie onde a totipotência foi comprovada, através
da embriogénese somática. No entanto, mesmo em Daucus, considerada como
modelo e facilmente induzível, existe uma influência genética na capacidade das
células para serem reprogramadas. Neste sentido, a identificação de marcadores
para a ‘fácil reprogramação’ pode ajudar ao desenvolvimento de marcadores
funcionais para a eficiente propagação in vitro de genótipos recalcitrantes. Tendo
como objetivo explorar esta questão e usando a oxidase alternativa como o gene
candidato a marcador funcional, 28 genótipos de Daucus foram induzidos a realizar
embriogénese somática indireta. Desses, 25 responderam ao processo, produzindo
139 linhas celulares. A eficiência embriogénica das linhas foi avaliada utilizando um
método de fenotipagem em dois passos, concebido para a seleção dos fenótipos
estáveis. Após o primeiro passo de fenotipagem, 41 linhas com eficiência
embriogénica estável foram avaliadas e caracterizadas em relação à diversidade
genética utilizando o método cTBP. Destas, 22 foram selecionados para o segundo
passo de fenotipagem. Finalmente, 8 linhas celulares foram identificadas, como
altamente estáveis para as eficiências embriogénicas extremas. Quatro eram muito
eficientes ou muito eficientes / eficientes, e as restantes não-embriogénicas. Estas
foram estabelecidas como a coleção base utilizada para uma avaliação mais
aprofundada, tanto em relação à ploidia, como na investigação da oxidase
alternativa. Foi detectada poliploidia em três das linhas celulares,
independentemente da sua capacidade embriogénica. No entanto, considerando a
mais recente informação, em que se refere a poliploidia como uma importante fonte
de variabilidade para a tolerância ao stress geral, a sua utilização no presente
estudo foi considerada. Os três genes da oxidase alternativa foram amplificados a
partir da coleção base e explorados tendo em vista a identificação de posições
polimórficas associadas com os fenótipos definidos. No total, 290 sequências foram
amplificadas, das quais 47 foram identificadas como polimórficas. Destas, 11 foram
identificadas como oxidase alternativa 1, 22 como 2a e 14 como 2b, sendo que a maior variabilidade foi detetada no gene 2a. As análises filogenéticas realizadas, não
permitiram a identificação de qualquer grupo de sequências associado a qualquer
um dos fenótipos em estudo. No entanto, a procura por elementos de regulação
realizada nas zonas codificantes em cada um dos genes, detetou três elementos nas
sequências do gene 2b, que estavam associados maioritariamente a linhas
embriogénicas. De igual forma, também os resultados do intrão 1 no gene 2b obtidos
a partir do IMeter, apontam este como possível regulador das atividades do gene
nessas linhas. Embora limitadas, tais observações apontam para o 2b, como sendo
o gene envolvido na capacidade das células de Daucus para desenvolver embriões.
No entanto, e dadas as limitações, tal indicação requer uma investigação mais
aprofundada; Abstract:
The somatic embryogenesis (SE) process is the most prominent example of cell
reprogramming. Daucus carota L. is the first species where totipotency through SE
was proven. However, even in an easily inducible plant like Daucus, the
reprogramming capacity of cells is largely influenced by their genotype. In this view,
the identification of markers for ‘easy-reprogramming’, is expected to help develop
functional markers for efficient biotechnological propagation of recalcitrant
genotypes. Aiming to explore this issue using alternative oxidase (AOX) as the
functional marker gene candidate, 28 Daucus accessions were induced to perform
SE. Of those, 25 were responsive, producing 139 true-to-type cell lines. SE
efficiencies were evaluated throughout a two-step phenotyping method planned for
the selection of stable phenotypes. After the first phenotyping step, 41 cell lines with
stable SE efficiency, were further analysed and characterized concerning genetic
diversity, using the cTBP method. From these, 22 were selected for the second
phenotyping step. Eight cell lines were identified at the end as highly stable for
extreme SE efficiencies. Four were very efficient or very efficient / efficient, and the
other four were non-embryogenic. Those were established as the basic collection
used for further poidy assessment and molecular analyses of AOX. Polyploidy was
detected in three of the cell lines, independently of their embryogenic capacity.
However, attending the recent studies reporting polyploidy as an important source of
variability for general stress tolerance, it was determined to proceed including them.
The three AOXs were amplified from the collection and explored in view of the
identification of polymorphic positions associated with the detected SE phenotype. In
total, 290 sequences were amplified, from which, 47 were identified as polymorphic.
From those, 11 were identified as AOX1, 22 as 2a and 14 as 2b, being AOX2a the
main source of sequence variability. General phylogenetic analysis did not allow the
identification of any group of sequences associated with any SE phenotype.
Nevertheless, the search for regulatory elements performed for each gene coding
region, detected three elements in the AOX2b sequences which were enriched in the
embryogenic lines. In the same way, also IMEter results obtained from AOX2b intron
1 sequences, reveal these as likely candidates to regulate gene activities. Such
observations, point to AOX2b, as a gene involved in the capacity of the Daucus cell's to develop embryos. However, given the limited observations, further investigation is
required to better substantiate this conclusion. |
URI: | http://hdl.handle.net/10174/20956 |
Type: | doctoralThesis |
Appears in Collections: | BIB - Formação Avançada - Teses de Doutoramento
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