Exploring alternative oxidase (AOX) as a functional marker candidate for efficient somatic embryogenesis in Daucus carota L.

Abstract

A embriogénese somática é o mais conhecido exemplo de reprogramação celular. Daucus carota L. foi a primeira espécie onde a totipotência foi comprovada, através da embriogénese somática. No entanto, mesmo em Daucus, considerada como modelo e facilmente induzível, existe uma influência genética na capacidade das células para serem reprogramadas. Neste sentido, a identificação de marcadores para a ‘fácil reprogramação’ pode ajudar ao desenvolvimento de marcadores funcionais para a eficiente propagação in vitro de genótipos recalcitrantes. Tendo como objetivo explorar esta questão e usando a oxidase alternativa como o gene candidato a marcador funcional, 28 genótipos de Daucus foram induzidos a realizar embriogénese somática indireta. Desses, 25 responderam ao processo, produzindo 139 linhas celulares. A eficiência embriogénica das linhas foi avaliada utilizando um método de fenotipagem em dois passos, concebido para a seleção dos fenótipos estáveis. Após o primeiro passo de fenotipagem, 41 linhas com eficiência embriogénica estável foram avaliadas e caracterizadas em relação à diversidade genética utilizando o método cTBP. Destas, 22 foram selecionados para o segundo passo de fenotipagem. Finalmente, 8 linhas celulares foram identificadas, como altamente estáveis para as eficiências embriogénicas extremas. Quatro eram muito eficientes ou muito eficientes / eficientes, e as restantes não-embriogénicas. Estas foram estabelecidas como a coleção base utilizada para uma avaliação mais aprofundada, tanto em relação à ploidia, como na investigação da oxidase alternativa. Foi detectada poliploidia em três das linhas celulares, independentemente da sua capacidade embriogénica. No entanto, considerando a mais recente informação, em que se refere a poliploidia como uma importante fonte de variabilidade para a tolerância ao stress geral, a sua utilização no presente estudo foi considerada. Os três genes da oxidase alternativa foram amplificados a partir da coleção base e explorados tendo em vista a identificação de posições polimórficas associadas com os fenótipos definidos. No total, 290 sequências foram amplificadas, das quais 47 foram identificadas como polimórficas. Destas, 11 foram identificadas como oxidase alternativa 1, 22 como 2a e 14 como 2b, sendo que a maior variabilidade foi detetada no gene 2a. As análises filogenéticas realizadas, não permitiram a identificação de qualquer grupo de sequências associado a qualquer um dos fenótipos em estudo. No entanto, a procura por elementos de regulação realizada nas zonas codificantes em cada um dos genes, detetou três elementos nas sequências do gene 2b, que estavam associados maioritariamente a linhas embriogénicas. De igual forma, também os resultados do intrão 1 no gene 2b obtidos a partir do IMeter, apontam este como possível regulador das atividades do gene nessas linhas. Embora limitadas, tais observações apontam para o 2b, como sendo o gene envolvido na capacidade das células de Daucus para desenvolver embriões. No entanto, e dadas as limitações, tal indicação requer uma investigação mais aprofundada; Abstract: The somatic embryogenesis (SE) process is the most prominent example of cell reprogramming. Daucus carota L. is the first species where totipotency through SE was proven. However, even in an easily inducible plant like Daucus, the reprogramming capacity of cells is largely influenced by their genotype. In this view, the identification of markers for ‘easy-reprogramming’, is expected to help develop functional markers for efficient biotechnological propagation of recalcitrant genotypes. Aiming to explore this issue using alternative oxidase (AOX) as the functional marker gene candidate, 28 Daucus accessions were induced to perform SE. Of those, 25 were responsive, producing 139 true-to-type cell lines. SE efficiencies were evaluated throughout a two-step phenotyping method planned for the selection of stable phenotypes. After the first phenotyping step, 41 cell lines with stable SE efficiency, were further analysed and characterized concerning genetic diversity, using the cTBP method. From these, 22 were selected for the second phenotyping step. Eight cell lines were identified at the end as highly stable for extreme SE efficiencies. Four were very efficient or very efficient / efficient, and the other four were non-embryogenic. Those were established as the basic collection used for further poidy assessment and molecular analyses of AOX. Polyploidy was detected in three of the cell lines, independently of their embryogenic capacity. However, attending the recent studies reporting polyploidy as an important source of variability for general stress tolerance, it was determined to proceed including them. The three AOXs were amplified from the collection and explored in view of the identification of polymorphic positions associated with the detected SE phenotype. In total, 290 sequences were amplified, from which, 47 were identified as polymorphic. From those, 11 were identified as AOX1, 22 as 2a and 14 as 2b, being AOX2a the main source of sequence variability. General phylogenetic analysis did not allow the identification of any group of sequences associated with any SE phenotype. Nevertheless, the search for regulatory elements performed for each gene coding region, detected three elements in the AOX2b sequences which were enriched in the embryogenic lines. In the same way, also IMEter results obtained from AOX2b intron 1 sequences, reveal these as likely candidates to regulate gene activities. Such observations, point to AOX2b, as a gene involved in the capacity of the Daucus cell's to develop embryos. However, given the limited observations, further investigation is required to better substantiate this conclusion.