Neural Mechanisms of olfactory discrimination in the Senegalese sole, Solea senegalensis Kaup, 1858

Abstract

O ambiente aquático é frequentemente escuro e turvo, tal leva a que muitos peixes e outros organismos não utilizem a visão como principal sentido de orientação. No entanto, este ambiente é geralmente rico em diferentes compostos químicos que se encontram dissolvidos na água, o que faz com que muitos organismos tenham os sentidos químico-sensoriais muito desenvolvidos, especialmente espécies nocturnas e/ou que habitam águas de elevada turbidez. O linguado Senegalês é um peixe bentónico pertencente ao grupo dos peixes chatos (Pleuronectiformes). Tal como a maioria dos peixes deste grupo o linguado passa grande parte do tempo parcialmente enterrado na areia, ficando apenas com os olhos e a narina superior expostos à coluna de água. As principais presas desta espécie são organismos bentónicos que vivem enterrados na areia, tais como poliquetas e crustáceos. Durante a metamorfose, o olho esquerdo migra para o lado superior (direito), no entanto, a narina esquerda não migra permanecendo no lado inferior (esquerdo). Em consequência, os dois epitélios olfactivos do linguado encontram-se expostos a diferentes ambientes; a narina superior amostra a coluna de água, enquanto a narina inferior amostra a água intersticial. Alguns odorantes são detectados de forma diferencial pelos dois epitélios olfactivos, sugerindo a existência de diferenças funcionais no papel que cada uma das narinas desempenha; um fenómeno nunca antes descrito em vertebrados. Esta singularidade faz do linguado um modelo bastante atractivo para o estudo dos mecanismos envolvidos na detecção e descriminação olfactiva. Assim sendo, o principal desafio deste trabalho foi compreender a importância funcional da detecção olfactiva diferencial e alargar o conhecimento referente aos mecanismos de detecção olfactiva no linguado Senegalês. Numa tentativa de estabelecer uma relação entre a diferencial sensibilidade olfactiva e a função dos odorantes envolvidos neste fenómeno, foi feita a identificação química de compostos olfactivamente activos presentes em estímulos relacionados com a detecção e localização de presas e com possíveis interacções intra-específicas. Em adição, foram investigadas as vias de transdução envolvidas na detecção dos compostos identificados. Uma vez que o linguado é frequentemente encontrado em ambientes de salinidade relativamente baixa, foi também avaliada a sensibilidade olfactiva a diferenças nas concentrações de Ca 2+ e Na-', assim como o efeito da salinidade na acuidade olfactiva nesta espécie. Na poliqueta Hediste diversicolor, presa comum do linguado, foram identificados odorantes no seu macerado e na água condicionada por este anelídeo. Ambas as amostras foram fraccionadas por filtração baseada no peso molecular e extracção por fase sólida (colunas C18). A potência olfactiva das fracções resultantes foi avaliada através do electro-olfactograma (EOG). A maioria dos odorantes detectados no macerado são compostos relativamente hidrofilicos de baixo peso molecular (<500Da). Os aminoácidos, em geral, têm estas características químicas e é sabido que os peixes são olfactivamente sensíveis a L-aminoácidos. Perante a possível contribuição de aminoácidos para a potência olfactiva do macerado, o seu conteúdo em aminoácidos foi avaliado por cromatografia gasosa associada a espectrometria de massa (GC-MS). Os aminoácidos mais abundantes no macerado são a glicina e o L-ácido aspártico; a glicina é um estímulo olfactivo forte, no entanto, o linguado é pouco sensível ao L-ácido aspartico. Os restantes aminoácidos mais abundantes são L-histidina, L-prolina, L-alanina e L-asparagina. ### Abstract - Fish face many problems in finding their way around their environment, which is immense, dense, often dark and often devoid of visual cues. Furthermore, the aquatic medium contains many dissolved compounds. Thus, many aquatic animals have acute chemical senses, specially those species with nocturnal activity or habitats with high water turbidity, which can help them navigate and find conspecifics and prey or avoid enemies. The Senegalese sole is a benthic nocturnal flatfish, which typically spends most of its time half-buried in sand with only its eyes and upper nostril exposed to open water, and feeds on benthic organisms, such as crustaceans and polychaetes, which live in the sand. During metamorphosis, the left nostril remains on the left (lower) side of the head, unlike the left eye which migrates to the right side of the head. Therefore, these fish have two olfactory epithelia exposed to two distinct environments; the upper nostril samples open water whilst the lower nostril samples interstitial water. It has been shown that the two olfactory epithelia of sole have different sensitivities to a number of different compounds suggesting that there is a functional difference between the roles that the two nostrils play. This functional asymmetry has never been described before in a vertebrate; this makes the sole a highly attractive model to study the mechanisms involved in olfactory detection and discrimination. Thus, the central challenge of this study was to understand the functional importance of differential detection by the two olfactory epithelia and to further our knowledge of the neuronal mechanisms involved in olfactory perception in the sole. To establish a possible relation between differential olfactory detection and the functional importance of the odorants, odorants related to food search and intra-specific interactions in sole were identified, and the signal transduction pathways involved in the detection of the identified compounds in both olfactory epithelia were investigated. Given that sole often lives in estuaries, where salinity can change rapidly, we also evaluated the olfactory sensitivity to changes in environmental [Na and [Cal and the effects of changes of salinity on olfactory sensitivity. The food stimuli used in chemical identification studies were macerates of the polychaete Hediste diversicolor and water containing compounds released by living worms. Both samples were fractionated by molecular weight filtration followed by C18 solid-phase extraction and the olfactory potency of the resultant fractions was assessed by the electro-olfactogram (EOG). Most of the odorants detected by sole in the ragworm macerate were low molecular weight (<500Da) relatively hydrophilic compounds. Amino acids, in general, have these chemical features and fish are, in general, sensitive to L-amino acids. Thus, the amino acid content of the macerate was analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The most abundant amino acids present in the macerate were glycine and L-aspartic acid; although sole is sensitive to glycine, acidic amino acids such as aspartic acid are weak odorants. The next most abundant amino acids were L-histidine, L-proline, L-alanine and L-asparagine. Sole is insensitive to L-histidine and L-proline; however, L-alanine and L-asparagine are potent odorants. To evaluate the relative contribution of amino acids to the olfactory potency of ragworm macerate, the olfactory activity of an artificial mixture of amino acids at the same concentration as measured in the macerate was evaluated. Our results confirmed that, in the macerate, the vast majority of the olfactory potency is likely to be due to the presence of amino acids.