Studies on the potential of alternative oxidase (AOX) as a functional marker candidate for efficient aventitious rooting in olive (Olea europaea L.)

Abstract

O envolvimento e a importância da oxidase alternativa (AOX) na resposta das plantas a diversas condições de stress têm vindo a ser demonstrado. Tendo em conta esse conhecimento, colocou-se a seguinte hipótese: “o enraizamento adventício (EA) é a uma reação da planta ao stress abiótico no qual a AOX tem um papel determinante”. Com a finalidade de testar a hipótese e avaliar o potencial da AOX para o desenvolvimento de um marcador funcional (MF), relacionado com a eficiência no enraizamento adventício (EA) em Olea europaea L., quatro genes AOX foram isolados (OeAOX1a, OeAOX1b, OeAOX1c e OeAOX2). O envolvimento da AOX na resposta fisiológica ao EA foi estudado em dois sistemas distintos, num utilizando estacas semi-lenhosas e noutro microestacas. As cultivares de oliveira, ‘Galega vulgar’, recalcitrante ao enraizamento por estacaria semilenhosa e ‘Cobrançosa’, de fácil enraizamento por este processo, foram utilizadas nos ensaios. Os resultados obtidos em ambos os sistemas mostraram que o EA é significativamente reduzido pelo tratamento com um inibidor da AOX, o ácido salicilhidroxâmico (SHAM), enquanto que tratamentos com peróxido de hidrogénio ou piruvato, ambos indutores da AOX, resultaram num aumento das taxas de EA. Resultados similares foram obtidos de microestcas de ‘Galega vulgar’. O SHAM, reduziu significativamente o EA, resultado que foi confirmado por análises histológicas, porém não inibiu a formação de calli. As análises de metabólitos mostraram uma redução significativa na quantidade de fenilpropanóides e de lignina após o tratamento com SHAM, indicando que a atividade da AOX durante o EA estará associada ao metabolismo de adaptação desses metabólitos. O estudo da variabilidade nos genes AOX, realizado ao nível do ADN e ARN, centrou-se no gene OeAOX2. A maior frequência de polimorfismos foi identificada na extremidade 3'UTR. Diferenças no nível de acumulação de transcrito durante o EA foram observadas apenas quando se utilizou um primer reverse localizado na 3'UTR, o que indica a ocorrência de uma modificação pos-transcripcional. Em suma, os resultados obtidos permitem considerar a AOX como enzima chave no processo de reprogramação celular associado ao EA. Em suma, os resultados obtidos permitem considerar a AOX como enzima chave no processo de reprogramação celular associado ao EA. Os resultados desta tese são encorajadores e abrem uma linha de investigação promissora com um grande potencial de aplicação que deverá ser considerado a nível regional/nacional/internacional; ‘Studies on the potential of alternative oxidase (AOX) as a functional marker candidate for efficient adventitious rooting in olive (Olea europaea L.)’ Abstract :It has been suggested that alternative oxidase (AOX) plays an important role during plant stress responses. In this thesis the hypothesis is that root induction is a plant cell reaction linked to abiotic stress and that the activity of stress-induced AOX is important for adventitious rooting (AR). In order to investigate AOX as a functional marker (FM) to assist AR efficiency in Olea europaea L., four AOX gene members (OeAOX1a, OeAOX1b, OeAOX1c e OeAOX2) were isolated from ‘Galega vulgar’, a cultivar with low AR efficiency. The involvement of AOX in AR physiological responses was studied in two different system, using a semi-hardwood cuttings and another microcuttings. The olive cultivars 'Galega Vulgar', recalcitrant rooting by semi-hardwood and 'Cobrançosa', easy to root for this process were used in the tests. Rooting was significantly reduced by treatment with salicylhydroxamic acid (SHAM), whereas treatment with hydrogen peroxide or pyruvate, increased the degree of rooting. A similar approach was adopted using microshoots of the cultivar ‘Galega vulgar’. SHAM significantly reduced AR, which was confirmed by histological analysis, but failed to exhibit any effect on the preceding calli stage. Metabolite analyses showed that the amounts of phenylpropanoids and lignin were significantly reduced following SHAM treatment, indicating that the influence of AOX activity on root formation was associated with adaptive phenylpropanoid- and lignin- metabolism. A detailed study of DNA and RNA level was carried out on OeAOX2. 3’-UTR was the most important source for polymorphisms. Differential transcript accumulation of OeAOX2 during AR induction was observed when using primers in the 3’UTR indicating posttranscriptional modification. In summary, the results obtained allow to consider AOX as a key enzyme in cellular reprogramming associated with the EA process. The results of this thesis are encouraging and open a promising line of research with a great potential for application to be considered at regional / national / international level.